高通量测序在新生儿遗传代谢病筛查中的应用研究

尹欢 雷菊芳 陈小林 程红斌

黄石市妇幼保健院新生儿科，黄石 435000

随着遗传代谢病在新生儿中的发病率不断增加，对该领域的研究和筛查手段的改进变得越来越重要［1］。传统的新生儿遗传代谢病筛查方法基于血液中特定代谢产物或酶活性的测定，虽然可以识别一些常见的代谢病，但仍存在一些技术限制和盲区［2］。近年来，高通量测序（next-generation sequencing，NGS）技术的出现为新生儿遗传代谢病筛查提供了新的机会［3］。NGS 技术具有高通量、高准确性和多样性检测能力的特点，可以同时对多个基因进行测序和分析，从而实现对遗传代谢病相关基因的全面检测和筛查［4］。NGS 在新生儿遗传代谢病筛查中可以通过建立基因组测序数据库和分析平台，对与遗传代谢病相关的基因进行系统和全面的收集和整理［5-6］。这样可以为筛查提供更准确、全面的遗传信息，并为后续的临床诊断和治疗提供科学依据。因此，本研究通过选取2021 年1 月至2023 年6 月黄石市妇幼保健院新生儿重症监护病房（neontal intensive care unit，NICU）住院的不明原因的酸中毒、脑病等185 例危重新生儿病例为研究对象，旨在分析NGS 在新生儿遗传代谢病筛查中的应用价值，现将结果报道如下。

资料与方法

1.一般资料

采用前瞻性研究方式，选取2021 年1 月至2023 年6 月黄石市妇幼保健院NICU 住院的不明原因的酸中毒、脑病等185 例危重新生儿病例为研究对象，其中男95 例、女90 例。⑴纳入标准：入住我院NICU 病房，存在不明原因的酸中毒、脑病表现；出生时间在72 h 以上，接受充分哺乳；根据病情考虑某种遗传代谢病；样本采集完整，检测结果完整；监护人签署知情同意书，充分了解研究相关内容。⑵排除标准：受试者入组前存在输注异体血制品情况；存在遗传病家族史，临床已确诊遗传性疾病；监护者接受宣教后表示拒绝参与研究。

本研究已获黄石市妇幼保健院医学伦理委员会审批（XSEK-2022-003）。

2.方法

2.1.时间免疫荧光法 采用时间分辨免疫荧光法检测干血片促甲状腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、17α-羟孕酮（17-hydroxyprogesterone，17α-OHP）及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）水平。阳性判读及处理：当TSH≥6.8 mU/L，17α-OHP≥1 nmol/L，G6PD≤26 U/dl为初筛阳性，对新生儿进行召回复查，若结果仍高于截断值者视为可疑病例，转诊至专科门诊进行确诊、治疗、随访管理等。

2.2.串联质谱法 采用串联质谱技术检测干血片中11 种氨基酸和31 种酰基肉碱的水平，制备内标准品和日常工作溶液，采用非衍生化法进行检测，即每个含有滤纸血片的板孔内添加100 μl 的日常工作溶液。封盖后，置于振荡器内，在45℃（±5℃）下震荡45 min。然后从每个板块中转移75 μl溶液至V 型底、耐热微孔板内，使用铝箔封套覆盖。微孔板置入自动进样器中，利用串联质谱仪进行测定。阳性判读：最初按2 000例正常新生儿检测值的99%的可信区间设置各指标的参考范围，所有截断值随样本的增加而不断修正，当分析物指标超过截断值时，电话召回重新采血复查，若检查结果仍是同一指标高于截断值，则判断为阳性，视为可疑病例。转诊至专科门诊进行确诊、治疗、随访管理等。

2.3.实验室检测 ⑴基因捕获探针的制备：设计包括与遗传代谢病病种相关的已知致病基因202 个，使用GenCap（北京迈基诺公司）基因捕获探针技术合成DNA 探针，命名为NeoEXOMEM，探针覆盖外显子区及已知致病的非编码区。⑵血浆DNA 的提取：使用QIAamp DNA Mini Kit（德国：QIAGEN）提取干血斑样本的基因组DNA。⑶测序：使用新生儿基因捕获试剂盒NeoEXOMEM（北京：QIAamp DNA Blood Mini Kit）对目标区域进行液相杂交捕获。富集文库使用HiSeqX10系统（llumina）进行150-bp双端测序。

3.数据处理

采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计数资料用率（%）表示，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示。

结果

1.新生儿一般信息分析

185例新生儿中，男性占51.35%，女性占48.65%。早产儿占7.57%，辅助生殖占8.11%，新生儿及母亲一般资料，见表1。

表1 185例新生儿一般信息分析

2.生化筛查结果分析

185 例受试新生儿中，生化筛查初筛阳性者15 例（8.10%），召回复测后阳性者5 例（2.70%）。其中，5 例复查阳性者分别为存在G6PD降低1例、17α-OHP升高1例、TSH升高1例、苯丙氨酸（Phe）升高2例。

3.NGS筛查结果分析

185 例受试新生儿中，NGS 筛查阳性6 例（3.24%），分别为DOUX2、MATIA、G6PD、CYP21A2 复合杂合突变各1 例，PAH 基因复合杂合突变2 例。此外，除阳性者外，存在隐性遗传病变异携带的新生儿有45 例（24.32%），阴性新生儿140例（72.43%）。

4.两种筛查结果比较

共6 例受试者筛查结果阳性，将生化筛查结果与NGS筛查结果比较，两种筛查结果一致有5 例，不一致有1 例，6 例患者中3 例得到确诊，分别为高苯丙氨酸血症1 例、21-羟化酶缺乏性先天性肾上腺皮质增生症1 例、先天性甲腺功能减退症1 例，见表2。以临床诊断为参考，将待确诊病历纳入真阳性中，生化筛查灵敏度为83.3%、特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，NGS 筛查灵敏度为100.0%、特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，见表3。对受试新生儿进行干预与随访，截至受试者3 月龄时，3 例确诊患儿及3例待确诊新生儿均发育正常。

表2 6例受试者筛查结果阳性新生儿临床信息及检测结果

表3 生化、NGS新生儿遗传代谢病筛查效能分析（例）

讨论

新生儿遗传代谢病是指由于基因突变导致新生儿体内某种特定的代谢酶缺乏或功能异常，进而引发一系列的代谢紊乱［7］。这些疾病通常在婴儿出生后不久就会表现出症状。根据统计数据，全球范围内新生儿遗传代谢病的发病率为1/3 000～1/4 000［8］。这意味着在每1 000 个新生儿中，有1～2 个患有遗传代谢病。这些疾病的好发年龄段多集中在新生儿期，因为新生儿的代谢系统尚未完全成熟，对某些代谢物的处理和转化能力相对较弱［9］。一些特定的遗传代谢病也可能在婴儿生长发育过程中逐渐显现。许多新生儿遗传代谢病若不及时发现和治疗，可能会导致严重的并发症，如神经系统损害、智力发育迟缓、器官功能障碍等［10-12］。筛查对于新生儿遗传代谢病非常重要，因为这些疾病在出生后很短的时间内就会表现出症状。通过及早的筛查，医生可以尽早发现潜在的遗传代谢病，采取相应的治疗措施，以减轻症状和避免严重的并发症。生化筛查是一种通过检测新生儿体内特定代谢产物或酶活性水平来发现遗传代谢病的筛查方法［13］。在新生儿遗传代谢病中，常用的生化筛查技术包括串联质谱技术和时间分辨免疫荧光法［14］。生化筛查技术在新生儿遗传代谢病的应用现状较为广泛，可以快速、准确地诊断很多常见的遗传代谢病。它可以帮助医生及早发现潜在的遗传代谢病，从而尽早采取治疗措施，减轻症状和避免严重的并发症［15］。但是生化筛查技术也存在一些不足之处：有时结果可能会出现假阳性或假阴性的情况，需要经过进一步的确认和检测，以确定是否确实存在遗传代谢病。生化筛查技术通常只能检测已知的特定代谢病，对于新颖或未知的代谢病可能无法进行有效的筛查［16］。生化筛查通常是定性或半定量的结果，无法提供详细的遗传突变信息，对于某些复杂的遗传代谢病，可能需要进一步的基因检测来确定诊断。NGS 筛查是一种利用先进的DNA 测序技术对新生儿进行遗传代谢病筛查的方法。它通过对患儿的基因组或特定基因区域进行深度测序，可以全面、高效地检测大量的基因突变和变异。

本研究中，通过选取2021 年1 月至2023 年6 月黄石市妇幼保健院NICU 住院的不明原因的酸中毒、脑病等危重新生儿病例185 例为研究对象。所有受试者均采集足跟血，实施生化筛查（串联质谱技术、时间分辨免疫荧光法）、NGS筛查。结果发现185 例受试新生儿中，生化筛查初筛阳性者15 例（8.10%），召回复测后阳性者5 例（2.70%），其中，5例复查阳性者分别为存在G6PD 降低1例、17α-OHP升高1例、TSH 升高1 例、Phe 升高2 例。185 例受试新生儿中，NGS 筛查阳性6 例，阳性筛查率为3.24%，分别为DOUX2、MATIA、G6PD、CYP21A2 复合杂合突变各1 例，PAH 基因复合杂合突变2 例。此外，除阳性者外，存在隐性遗传病变异携带的新生儿有45 例（24.32%），阴性新生儿140 例（72.43%）。这与国内同类型文献结果基本一致［17-18］。

两种筛查结果一致有5 例，不一致有1 例，6 例患者中3例得到确诊，分别为高苯丙氨酸血症1例、21-羟化酶缺乏性先天性肾上腺皮质增生症1 例、先天性甲状腺功能减退症1 例。以临床诊断为参考，将待确诊病例纳入真阳性中，生化筛查灵敏度为83.3%、特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%，NGS 筛查灵敏度为100.0%、特异度为100.0%，阳性预测值为100.0%。NGS筛查新生儿遗传代谢病相较于生化筛查具有更高的准确度和更全面的优势，NGS 技术可以对多个基因或整个进行深度测序，能够检测多个基因的突变和变异。相比之下，生化筛查主要依赖于单个或有限数量的生化指标来检测特定代谢物的异常。由于新生儿遗传代谢病涉及多个基因的突变，NGS筛查能够提供更全面、更准确的结果，避免了漏诊或误诊的情况［19］。NGS 筛查可以覆盖大量的基因和变异，不仅可以发现已知的遗传代谢病，还可以发现罕见的变异和新的遗传代谢病。与之相比，生化筛查通常只针对少数常见的遗传代谢病进行筛查，无法覆盖到所有可能的变异。NGS 筛查具有高敏感性，即使是罕见的基因突变也能被检测到。而在生化筛查中，如果某个代谢物的异常不在筛查范围内或突变频率很低，可能无法被及时发现［20］。NGS筛查不仅可以检测突变、变异，还可以提供关于患者基因组中其他相关基因的信息，这些额外的信息有助于了解疾病的发病机制、预测疾病进展、指导个体化的治疗方案等。尽管NGS 筛查具有上述优势，但也需要注意，NGS筛查技术的检测结果需要进一步的验证和解释，同时，数据分析和解读的复杂性以及高成本也是其应用的挑战。而生化筛查则相对简单，成本较低，对于一些常见遗传代谢病也能够提供有效的筛查和诊断。因此，在实际应用中，根据具体情况和资源限制，可以选择合适的筛查方法。

综上所述，NGS 筛查准确度较高，可较为全面的诊断新生儿遗传代谢病。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明尹欢：研究设计与实施、采集数据、分析/解释数据、起草文章、统计分析；雷菊芳：研究设计与实施、采集数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导；陈小林：实施研究、数据采集与分析；程红斌：研究设计、对文章的知识性内容作批评性审阅、指导