Wnt蛋白在皮肤鳞状细胞癌与基底细胞癌中的表达情况研究

袁燕平 张卢舜

九江学院附属医院病理科，九江 332000

非黑色素瘤属于人类最常见的皮肤恶性肿瘤，包括基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）和鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）两个类型。SCC 约占所有皮肤恶性肿瘤的29.4%，而BCC 约占28.0%［1］。BCC 和SCC 的病因及发病机制目前尚不十分清楚，但已证实与紫外线照射、电离辐射、人乳头瘤病毒、化学致癌物、器官移植和免疫抑制等有关。BCC 的临床特点是具有局部侵袭性，但是远处转移并不常见。BCC 的组织形态有相当大的变异性，存在许多病理学亚型，包括结节型、表浅型、囊肿型、腺样型、色素型、硬斑型、异形型、纤维上皮瘤和痣样基底细胞上皮瘤型［2］。SCC 是人类第二常见的皮肤恶性肿瘤。SCC 和BCC 在生物学行为上有所不同，临床上常常可见SCC 很早就发生转移。

Wnt 信号通路通常分为经典和非经典信号通路［3-11］。Wnt10a和Wnt10b是经典通路的重要成员，它们可以激活经典的Wnt/β-catenin/Tcf信号通路从而发挥作用，而Wnt5a蛋白主要介导激活非经典Wnt 信号通路。Wnt 信号通路已被证明是许多恶性肿瘤发生发展的重要因素［3-6］。在黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、原发性肝癌、甲状腺癌、白血病等肿瘤组织中均发现Wnt 信号通路关键蛋白β-catenin 的核内聚集现象。对于Wnt信号通路在黑色素瘤中的作用研究报道较多，现已发现β-catenin 在黑色素瘤细胞胞质和胞核内显示较高的表达状态，当黑色素瘤细胞的β-catenin 基因被敲除后，细胞的生长增殖受到抑制，但是转移能力反而增强，这是因为β-catenin 介导的细胞黏附作用被削弱了［7-8］。为了探索Wnt 信号通路在非黑色素瘤形成中的作用，本试验同时检测了SCC 和BCC 中Wnt5a、Wntb、β-catenin 和Wnt10a 的表达情况，结果显示4 种蛋白在两种肿瘤中的表达情况大不相同，部分蛋白显示出明显的差异化表达。

资料与方法

1.标本和试剂来源

收集2021 年1 月至12 月在九江学院附属医院皮肤科就诊并且经过病理科确诊的33例BCC和33例SCC标本，其中男28例，女38例，年龄45～88岁。

本研究经九江学院附属医院医学伦理委员会批准（L2021023），所获得的样本均征得患者及家属知情同意并签署知情同意书。

兔抗人Wnt5a（稀释比1∶200）多克隆抗体和Wnt10a（稀释比1∶200）多克隆抗体购自Bioss 公司，兔抗人Wnt10a（稀释比1∶200）多克隆抗体购自proteintech 公司，二抗、SP法免疫组化试剂盒和DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2.方法

采用SP 法，操作流程如下：所有标本均经10%福尔马林固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，以3 μm 厚度连续切片，微波修复，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，之后进行血清封闭。依次加入一抗、二抗及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，DAB 显色，苏木精对比染色，常规脱水，透明，中性树胶封固。磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

3.结果判定

免疫组织化学染色判读采用着色强度积分与数量积分相加的方法。将阳性细胞百分比分成5 级。无阳性细胞为0 分，阳性细胞≤25%为1 分，25%～≤50%为2 分，50%～≤75%为3 分，＞75%为4 分。着色强度无色为0 分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。着色强度积分与数量积分相加：1 分为（-），2～3 分为（+），4～5 分为（++），6～7 分为（+++），其中（-）和（+）定为阴性，而（++）和（+++）定为阳性。试验结果由2 位经验丰富的病理诊断医生（副主任医师）采用双盲法独立阅片并打分。

4.统计学分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，当P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.Wnt10a、Wnt10b、Wnt5a、β-catenin在BCC中的表达

在所有BCC 病例中，肿瘤细胞区域均可见Wnt10b、Wnt5a 和β-catenin 的强烈表达（图1A、B、C）；部分病例中Wnt10b、Wnt5a 也微弱地表达在间质细胞中（图1B、C 箭头所示）；但是，所有病例均未见Wnt10a 的表达，在无论是肿瘤区域还是其他区域均为阴性（图1D）。

图1 基底细胞癌（BCC）样本中β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a的免疫组织化学染色表达情况（免疫组织化学 ×400）。癌组织巢细胞中可见明显的β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 表达（A、B、C），而Wnt10a 则为阴性表达（D）。在肿瘤间质细胞（黑色箭头）可见Wnt10b、Wnt5a的表达

2.Wnt10a、Wnt10b、Wnt5a和β-catenin在SCC中的表达

在所有SCC 病例中，肿瘤细胞区域均可见Wnt10b、Wnt5a 和β-catenin 的强烈表达（图2A、B、C）；在病例中Wnt10b、Wnt5a 也微弱地表达在间质细胞中（图2B、C 箭头所示）；Wnt10a在所有SCC 病例中呈阴性表达的有23例，呈现阳性表达有10例，阳性表达率为30.3%（10/33）。

图2 鳞状细胞癌（SCC）样本中β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a 的免疫组化染色表达情况（免疫组织化学 ×400）。癌组织细胞中可见明显的β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a 表达（A、B、C、D），表达部位包括细胞核和细胞浆。在肿瘤间质细胞（黑色箭头）可见Wnt10b、Wnt5a 的表达，而未见β-catenin 和Wnt10a表达

3.Wnt10a在BCC和SCC中的表达

Wnt10a 在BCC 中的阳性表达率为0，而在SCC 中出现4例中等强度表达，6例强阳性表达，阳性率为30.3%（10/33）。在SCC 中，Wnt10a 主要表达在肿瘤细胞的胞浆，极少表达在胞核区，在肿瘤间质未见表达。Wnt10a 在BCC 和SCC 中的表达差异有统计学意义（χ2=11.785 7，P＜0.05）。见表1、图3。

图3 不同鳞状细胞癌（SCC）样本中的Wnt10a 的免疫组织化学染色表达情况（A2-C2免疫组织化学 ×400）。绝大部分样本中未见Wnt10a 表达（A1、A2），个别样本中可见微弱的Wnt10a 表达于癌巢边缘肿瘤细胞内（B1、B2），另有少部分样本中癌组织细胞中可见明显的Wnt10a 表达（C1、C2），主要位于细胞的胞浆和胞核

表1 Wnt10a在BCC和SCC样本中的表达情况比较

讨论

Wnt 信号通路在调节细胞生长、增殖和分化以及胚胎发育过程中起着重要作用。Wnt 蛋白家族成员的异常表达可导致Wnt 信号通路激活，进而参与多种肿瘤的发生、发展［8，12］。对于Wnt信号通路的最新研究发现，细胞内Wnt信号通路至少有3个分支。⑴经典型Wnt/β-catenin 信号通路：β-catenin 是一种细胞质蛋白，分子量95 kD，它直接与E-钙黏蛋白的胞内结构域结合，控制着细胞的附着、增殖和分化等功能；⑵JNK 信号通路（planar cell polarity）；⑶Wnt/Ca2+信号通路［12-13］。

目前，对Wnt 信号通路的研究较为深入。Wnt 蛋白是一类分泌糖蛋白，共有19 种，其中属于经典途径的有Wnt10a、Wnt8A、Wnt3A、Wnt3、Wnt2、Wnt1、Wnt8B、Wnt10b［12］。Wnt 蛋白与卷曲蛋白和LRP5/6 形成复合物后活化胞内DVL，从而导致降解复合体中GSK-3β 的活性丧失，阻断β-catenin 的磷酸化进程，这导致β-catenin 逃避活性酶的识别和降解，由此引起细胞内β-catenin 出现堆积，堆积到一定程度后入核结合核转录因子，暴露下游靶基因的启动子，至此靶基因被激活并且表达，致使细胞异常增殖。笔者在BCC 和SCC 中都发现了β-catenin 的过表达和聚集现象，表明经典Wnt信号通路参与了两种肿瘤的发生，其与皮肤恶性肿瘤关系密切，这一点也与之前的文献报道相同［8］。

利用转染的方法抑制多种结直肠癌细胞系中Wnt10a基因表达后，细胞的代谢被明显抑制，肿瘤细胞的生长速度也明显降低［14］。其他研究也发现，Wnt10a 蛋白在食管癌、胃癌、肾癌、结直肠癌以及子宫内膜样癌中也发挥着关键性的作用［15-17］。本研究发现，所有BCC 中均未见Wnt10a 表达，而SCC 病例中则有部分样本出现阳性表达，这说明Wnt10a 积极参与了SCC 的癌变过程。与正常皮肤中的角质形成细胞相比，皮肤SCC 细胞中的β-catenin 表达水平显著增加［18］，本研究也观察到相同情况。这表明Wnt10b的高表达激活了Wnt/β-catenin/Tcf 信号通路，细胞内β-catenin不断累积后，不但促进癌细胞的快速增殖，还导致细胞发生远处转移。

人们在研究小鼠乳腺肿瘤病毒时发现，激活Wnt10b 基因后可导致小鼠产生乳腺肿瘤，由此发现了Wnt 蛋白家族新成员——Wnt10b。1997 年Bui等［19］首次发现并描述了与鼠类Wnt10b 同源的人类基因，人类的Wnt10b 基因与鼠类基因在核苷酸和氨基酸水平的一致性分别达到了88%和95%。Wnt10b在人类乳腺癌、前列腺癌骨转移瘤、原发性肝癌和结肠癌中均出现异常高表达［20］，提示Wnt10b基因的过表达可能和这些肿瘤的发生发展密切相关。本研究观察到，Wnt10b 在两种皮肤肿瘤中的表达都是明显增多的，而在肿瘤细胞中的表达量是高于间质细胞的，说明Wnt10b 积极参与两种肿瘤的发生发展过程。

Wnt5a也是Wnt蛋白家族重要成员之一，可以激活经典Wnt信号通路，使下游β-catenin蛋白表达增加，进而参与肿瘤的发生发展，但在某些情况下它也可以抑制经典Wnt 信号通路［21-23］。研究发现，Wnt5a 在多种肿瘤中出现异常表达，如骨肉瘤、肝癌、前列腺癌、肺癌等［7，24-25］，Wnt5a 的mRNA 与肿瘤的转移关系密切，而且也与预后相关。Wnt5a在人体内的表达和作用具有组织器官特异性。因此，它既可以发挥促癌作用，又可发挥抑癌作用。结合本研究结果分析，笔者认为其对皮肤非黑色素肿瘤的促进作用是占主导地位的。

Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤中的作用已经被众多研究所证实［26-29］，但是笔者查阅文献发现其在皮肤非黑色素中的作用的研究相对较少。本研究显示，多种Wnt 蛋白高表达于SCC 和BCC 中，同时发现Wnt10a 在SCC 组织中的表达高于BCC 组织，差异有统计学意义（P＜0.05），说明经典和非经典Wnt 信号通路都参与了二者的发生发展过程，而其中Wnt10a 在两种肿瘤中发挥的作用不同，其更多地参与了SCC 的癌变过程。Wnt10a 在BCC 和SCC 中有着不同的作用，其内在的机制有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明袁燕平：酝酿和设计试验，实施研究，采集数据，分析/解释数据；张卢舜：起草文章，对文章的知识性内容作批评性审阅