脑类器官技术及在脑卒中治疗中的应用进展

孙可心，肖雨倩，万俊，陈淑颖，陈丽敏，王岩，白艳杰△

脑卒中是全球第二大死因，致残率高，并且近年来卒中发生和卒中死亡人数大幅度增加。脑卒中主要包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，前者可占所有脑卒中发生总数的62.4%［1］。目前，组织纤溶酶原激活剂（tPA）是唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗缺血性脑卒中的药物，但其治疗时间窗仅在脑卒中发生后4.5 h内，并且有引起脑缺血再灌注损伤的风险；而对于出血性脑卒中的治疗尚无特效药［2］。因此，迫切需要开发治疗脑卒中的有效方法以解决治疗时遇到的难题，达到提高疗效和改善患者预后的目的。在干细胞的研究基础上，学者开发出一种由胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）或诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）衍生诱导的与人脑结构类似的三维（three-dimensional，3D）培养系统，即脑类器官［3］。脑类器官在体外显示出神经连接和脑功能，例如大脑发育中各种细胞类型之间复杂的相互作用，概括了人脑的早期神经发育特征［4］。脑类器官移植可以在宿主脑内长时间存活，并且移植的脑类器官通过与宿主神经元形成突触连接实现生理功能整合，表明脑类器官对神经系统疾病存在治疗潜力［5］。因此，本文通过对脑类器官的研究进展及应用进行综述，探讨脑类器官作为脑卒中体外模型以及脑类器官移植治疗脑卒中的可行性、有效性和潜在机制。

1 脑类器官的发展概述

近年来，基于干细胞技术和细胞自组织原理已经生成类似于人脑的体外3D培养系统的脑类器官，并不断优化培养技术和相关脑部功能。Lancaster等［3］在2013 年建立了首个模拟人脑3D 结构的脑类器官。ESCs 和iPSCs 首先分裂并聚集成拟胚体（embryoid bodies，EBs），置于神经诱导培养基中诱导神经外胚层形成，随后将分化的EBs 嵌入基质胶液滴中并转移到旋转生物反应器中实现悬浮培养，以增强营养物质和氧气的扩散，使脑组织快速发育，由此产生的脑类器官为全脑类器官；其概括了人类大脑内的发育和遗传特征，并形成了不同的大脑区域，包括前脑、中脑、后脑、脉络丛和视网膜等细胞谱系，且包括小鼠大脑中不存在的外脑室下区［3，6］。

Lancaster 等［7］使用乙交酯丙交酯共聚物纤维微丝作为浮动支架生成微丝工程脑类器官，起到促进神经外胚层形成以及改善皮质发育的作用，这种3D细胞培养与生物工程相结合可以改善脑类器官组织结构并提高脑类器官构建的可重复性。需要注意的是，体外培养的脑类器官由于缺乏血液供应，后期神经元成熟受到氧气和营养供应不足的限制。为此，Lancaster团队后续开发了一种基于器官型切片培养技术的新方法，产生气液界面脑类器官，以改善脑类器官的氧气和营养供应，从而加速其成熟［8］。In-Hyun Park团队通过在培养基中添加人类ETS变体2转录因子以诱导脑皮质类器官（human cortical organoids，hCOs）的产生，在脑类器官中首次出现功能性血管样结构以及血脑屏障类似结构，显著提高脑类器官中神经元的成熟度［9］。

然而，干细胞自发分化的随机性可能导致不同批次分化的类器官之间存在差异，由上述方法得到的脑类器官仍存在异质性高的缺陷。因此研究者尝试通过在培养基中添加化学小分子和生长因子等物质的方法调控信号传导，定向诱导产生区域特异性的脑类器官，包括皮质、脉络丛、海马、中脑、小脑和下丘脑等［10］。见图1。Jacob 等［11］在体外培养EBs时，通过使用糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）抑制剂CHIR99021 和高水平的人重组骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7，BMP7）来提高Wnt 通路的信号传导，刺激神经祖细胞向脉络丛的方向发展，从而培养出脉络丛类器官（choroid plexus organoid，CPO），并用CPO模拟由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARSCoV-2）引起的病毒感染，验证感染SARS-CoV-2 后的发病机制是炎症反应和脉络丛细胞功能紊乱。此后，明国丽院士团队进一步报道了通过抑制SMAD和Wnt 信号通路、激活超音刺猬蛋白（sonic hedgehog，SHH）信号通路产生类似下丘脑亚区弓状核类器官的方法，用于解决精细的大脑亚区相关疾病［12］。研究表明，2 个或多个区域特异性脑类器官可以组合形成融合类器官，模拟大脑区域之间的相互作用，例如细胞迁移和远程连接［13］。区域特异性脑类器官可以模拟大脑的不同分区及模拟人类神经发育疾病，还可以揭示疾病的病理机制，未来可能成为潜在的治疗手段。

2 脑类器官与新兴技术的融合

随着对脑类器官研究的不断深入，脑类器官已经被用于研究大脑发育、神经疾病以及物种特异性药理学和毒理学等方面问题，并且其在治疗疾病方面逐渐显现出优势。研究证实，脑类器官可以通过结合脑类器官移植、基因编辑以及类器官芯片等组织工程技术治疗脑部疾病［14-15］。

2.1 脑类器官移植 体外培养的脑类器官由于缺乏功能性脉管系统会影响脑类器官中神经元的成熟和功能，导致坏死中心的形成，并进一步导致大脑内突触连接和神经回路的缺失。有研究显示，脑类器官移植有希望克服以上限制［5，16］。在移植到啮齿动物皮质的脑类器官中观察到宿主介导的功能性神经元网络和血管形成，减少了其中细胞的代谢应激并且提高细胞存活率［16］。此外，研究人员在大鼠的可塑性发育阶段（出生后3～7 d），将来自人iPSC 的hCOs 移植到早期无胸腺大鼠的初级躯体感觉皮质中，构建了人鼠混合大脑类器官（transplanted hCO，t-hCO），t-hCO 神经元在大鼠皮质区域以及皮质下区域广泛建立投影，诱导大鼠神经元中的突触反应从而驱动其行为反应，表明t-hCO 可以整合到宿主大脑并形成功能回路［5］。

脑类器官移植是目前将脑类器官应用于治疗神经系统疾病的主要手段。Wang 等［17］将脑类器官移植到创伤性脑损伤（TBI）大鼠受损的运动皮质，支持受损运动皮质的区域特异性重建，移植的脑类器官与宿主大脑之间形成了血管并减少细胞凋亡，同时上调同侧海马中的神经连接蛋白和神经营养因子，起到缓解脑损伤并改善神经运动功能的作用。与之类似的是，将由hiPSC 衍生的中脑类器官移植到帕金森小鼠模型大脑中，可起到改善小鼠运动功能和大脑微环境的作用［18］。在上述两个模型中，来自移植物的神经元沿着胼胝体逐渐向大脑不同区域广泛迁移，并与宿主大脑神经元形成双向突触连接，从而改善模型动物的神经运动功能［17-18］。脑类器官移植克服了体外培养脑类器官存在的难题，为脑类器官移植治疗神经系统疾病提供了光明前景。

2.2 基因编辑技术 基于成簇规律间隔短回文重复（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，CRISPR）的基因编辑技术正不断促进干细胞基因工程的发展。使用CRISPR 技术可以产生各种类型的基因突变体，将脑类器官和基因编辑技术相结合可应用于修复突变基因、高通量体外筛选和治疗疾病等领域。其中，CRISRP/Cas9 系统是目前广泛使用的基因编辑工具，也是目前被认为最简单高效的基因编辑手段［19］。Tang 等［20］研究表明，利用唐氏综合征患者的iPSCs结合CRISRP/Cas9 基因编辑技术，在体外建立抑制细胞黏附分子（down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM）/p21 激活激酶1（p21-Activated Kinase 1，PAK1）通路的皮质脑类器官，可以逆转异常的神经发生并增加脑类器官的尺寸。Esk等［21］使用一种基因筛查技术——CRISPR 谱系追踪（CRISPR-LICHT）测试了脑类器官组织中的173 个小头畸形候选基因，筛选出25个可能导致小头畸形发生的基因，并且通过使用基因敲除技术构建即刻早期反应3 相互作用蛋白1（immediate early response3 interacting protein1，IER3IP1）基因敲除的脑类器官，证实了IER3IP1 调节内质网功能和细胞外基质蛋白的分泌，对脑组织完整性以及大脑大小至关重要，其失调将导致小头畸形。AUTS2 基因突变与以智力障碍、小头畸形和先天性脑畸形为特征的广谱神经系统疾病有关，由小头畸形患者iPSCs产生的脑类器官表现出显著的生长迟缓，使用CRISRP/Cas9 技术来纠正AUTS2 基因突变，可有效恢复神经祖细胞的增殖活性和脑类器官的生长［22］。

此外，基因编辑技术也应用于脑类器官的发育。He等［23］将基于CRISPR的基因扰动整合到谱系记录器系统中，从而实现在脑类器官发育过程中对基因功能的调控，在神经外胚层形成之前靶向神经发育不良的相关基因结节性硬化症蛋白复合体2（tuberous sclerosis complex2，TSC2），发现TSC2 基因扰动可能增强脑类器官的新陈代谢并延迟神经发育。由此可见，基因编辑技术与脑类器官的结合不仅加快了对人类大脑基因的研究，更有望在未来进一步拓宽脑类器官在神经系统疾病中的研究领域及应用范围。

2.3 脑类器官芯片 传统方式培养的脑类器官难以复制人类大脑复杂的微环境，而微流体芯片技术能够以高通量方法模拟大脑内环境并进行精确调控，因此，以微流控技术为核心的脑类器官芯片平台应运而生［24］。脑类器官芯片由脑类器官培养室组成，并与培养基流动和灌注通道相连，微流体通过整合通道以创建流体流动和可控的微环境来引导脑类器官的形成［24-25］。这种脑类器官芯片技术已经被报道用于研究神经发育问题。Wang 等［26］使用脑类器官芯片作为人类大脑发育的模型，研究产前尼古丁暴露对神经发育的影响，证实在尼古丁处理的脑类器官中，神经元生长和皮质发育被破坏，表明尼古丁暴露会损害胎儿早期的大脑神经发育。

最近通过在微流体芯片上将由人iPSCs 衍生的周细胞和内皮细胞自组织形成的脉管系统与脑类器官共同培养，使其在芯片上相互作用可诱导脑类器官血管化。Salmon 等［27］研究证实，由上述方式培养的脑类器官增强了血管网络的灌注和通透性，加速了脑类器官的成熟。具有微柱阵列的微流体装置可以实现原位生成脑类器官，减少培养过程中EBs 的手动转移，与脑类器官传统培养方法相比，简化了其构建方案，降低了脑类器官异质性。此外，Cui 等［28］基于微柱陈列微流体装置开发了一个工程化脑类器官芯片平台，并用于研究癌细胞衍生的外泌体对妊娠早期人脑神经发育的影响，表明使用乳腺癌细胞来源的外泌体诱导分化形成的皮质类器官不仅表现出神经发育受损，还显示出与乳腺癌和髓母细胞瘤相关的信号通路激活，提示癌变风险。

脑类器官芯片呈现了更多与人脑相关的生理和病理特征，是了解神经发育疾病进展的新型工具，并且高精度控制大脑微环境的实现为开展个性化治疗提供有效途径，但目前由于其操作复杂耗时，标准化和扩大当前的脑类器官芯片模型仍然具有挑战性，未来仍需要更加先进的工程手段。

3 脑类器官在脑卒中的应用

3.1 脑类器官模拟脑卒中模型 目前对于脑卒中的研究主要在啮齿类动物模型中开展，而啮齿类动物大脑与人脑在解剖和组织功能上仍存在差异。此外，用于与人类有相似遗传背景的灵长类动物的研究，由于其操作要求较高及伦理等方面的问题无法在脑卒中的研究中普及［10］。脑类器官的出现为脑卒中相关研究提供了新的视角。干细胞衍生的3D 人脑类器官较细胞模型更有可能概括人脑的特征，并且越来越多地应用于脑卒中体外模型的构建［15］。

目前用脑类器官体外构建脑卒中模型的技术主要以致病因素和病理生理表现为切入点。研究人员尝试通过在体外对研究模型进行缺氧处理来模拟缺血性脑卒中。Kim等［29］通过诱导神经干细胞开发了脑类器官，并将脑类器官在分化培养基中培养48 d后转移到含有1%O2的缺氧室中，经过48 h实现脑类器官缺氧后，观察到脑类器官表现出与缺血性脑卒中患者和动物模型一致的神经元损伤，这种缺氧处理刺激促凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶3（cleavedcaspase-3）、多聚ADP 核糖聚合酶（cleaved-poly ADP-ribose polymerase，PARP）以及缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α）表达升高。

Wang 等［30］用不含葡萄糖的厄尔平衡盐溶液处理脑类器官，培育氧-葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）的脑类器官以模拟人缺血性脑卒中，结果表明随着OGD 暴露时间增长，脑类器官中cleaved-caspase-3的表达和细胞凋亡的发生逐渐增加，表明脑类器官的缺血性损伤程度与OGD暴露时间呈正比；一些脑卒中治疗药物，如依达拉奉和丁基苯酞等，在该模型中发挥的有益作用为脑卒中治疗药物开发提供了新的研究平台。目前该模型已经用于研究缺血性损伤机制，进一步表明3D脑类器官模型在研究缺血性脑卒中方面具备可行性［31］。

当缺血性脑卒中发生时，大脑脉管系统功能受损，这种血管结构由神经血管单元（neurovascular unit，NVU）形成，NVU可以维持血脑屏障（BBB）的完整性，保持其正常功能。Wevers 等［32］开发了一种基于微流体技术的人NVU 芯片模型，结合缺氧、缺糖和停止灌注3 种方法模拟缺血性脑卒中，研究结果显示NVU芯片培养物BBB完整性被破坏、线粒体膜电位降低以及腺苷三磷酸水平降低，这是缺血性脑卒中的常见特征，表明NVU芯片模型可用于脑卒中血管系统功能的基础研究。

综上可知，脑类器官正逐渐应用于缺血性脑卒中体外模型的构建，并在揭示缺血性损伤机制方面展现出潜在能力。但目前对脑卒中脑类器官模型的研究有限，脑卒中发病集中在老年人群，而模仿人类胎儿大脑发育的脑类器官无法准确概括与脑卒中相关的表型［1，4］。因此，未来的脑卒中模型构建需要研究血管化脑类器官在培养6个月或更长时间后的病理生理变化。

3.2 脑类器官治疗脑卒中 脑卒中发生后的病理生理机制十分复杂，兴奋性毒性、氧化应激和炎症反应等过程引起大脑神经元丢失，进一步导致人体运动和认知等功能障碍［33］。以往的研究明确了干细胞移植疗法通过促进神经发生和替换丢失的神经元来减轻脑损伤的作用，但疗效有限［34］。iPSCs衍生的脑类器官包括了神经祖细胞、神经干细胞、神经元和神经胶质细胞等多种细胞类型，因此脑类器官移植在一定程度上克服了干细胞移植的局限性［4］。

有研究表明，将3D脑类器官移植到小鼠双侧额叶和顶叶皮质中均显示出较高的存活率并发生血管化，同时在移植的脑类器官中观察到神经元投射，其轴突可沿宿主皮质脊髓束延伸至周围大脑皮质、胼胝体和宿主纹状体［35］。移植脑类器官的神经元不仅能够从宿主神经元接受突触传入并整合到宿主神经回路中，还可以接受来自宿主神经元的突触传出，从而形成双向突触连接［18］。此外，移植部位的不同将影响脑类器官分化的结局，在梗死周围脑类器官主要由成熟和未成熟的谷氨酰胺能神经元组成，而在梗死核心的脑类器官细胞可分化为神经胶质细胞；脑类器官在梗死周围区和梗死核心的不同分化结果可能是由不同的炎症微环境引起［36］。

已经有临床前证据表明，脑类器官移植可以通过改善脑损伤并促进功能重建治疗脑卒中。Wang等［37］将培养55 d的脑类器官移植到大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠脑内，显著减少了脑梗死体积，并改善了神经运动功能，移植的脑类器官与宿主大脑之间建立广泛突触连接，证实脑类器官移植治疗脑卒中的潜在机制与增强神经发生、突触重建、轴突再生以及减少神经元凋亡有关。此外，在移植组大鼠的海马CA1、CA2和CA3 亚区观察到神经发生，可能有助于脑卒中后学习记忆功能的改善，但需要今后进一步研究证实。来源于内侧神经节隆起（medial ganglionic eminence，MGE）的中间神经元是调节神经回路和神经活动的主要抑制性神经元，其释放的神经递质以γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）为主，脑卒中后GABA 能中间神经元缺失可能导致感觉运动障碍。Cao 等［38］通过光化学法诱导小鼠大脑血管内皮损伤，中断大脑局部血流成功建立MCAO模型，并通过激活SHH信号通路定向诱导人iPSCs分化以生成人MGE 脑类器官（human MGE organoids，hMGEOs），将hMGEOs 移植到MCAO 小鼠的梗死皮质中，发现移植的脑类器官存活良好，并且主要分化为GABA 能中间神经元，显著恢复了MCAO 小鼠的感觉运动功能。移植在MCAO小鼠梗死核心区的脑类器官可以实现长期存活，且更容易分化为神经胶质细胞，有利于修复梗死组织；同时，移植的脑类器官与宿主之间形成神经回路，进一步消除小鼠的感觉运动缺陷［36］。以上研究证明了脑类器官移植治疗脑卒中的有效性和潜在治疗机制。

小胶质细胞在脑卒中后可起调节免疫和炎症反应的作用，从而可减轻脑损伤，有利于功能恢复［33］。然而脑类器官中小胶质细胞的生成仍是一大难题，因此诱导脑类器官小胶质细胞分化可能成为未来脑类器官移植治疗脑卒中的研究重点。

4 小结与展望

近些年随着对脑类器官研究的不断深入，进一步克服了构建脑类器官及其应用时存在的局限性。通过优化脑类器官的培养方法可减少异质性、降低成本、提高可重复性，并逐渐完善体外培养脑类器官的功能；与新兴技术结合促进了脑类器官的成熟、功能性血管网络的形成和神经回路的生成，并将其应用于疾病建模及在治疗神经系统疾病中显示出疗效。其中，构建脑卒中体外3D模型和在体移植脑类器官为研究新的治疗方法及药物疗效提供新方法、新思路。但是，目前对脑类器官的研究仍处于起步阶段，关于如何建立脑类器官神经血管网络及免疫系统，进而精确模拟大脑动态微环境仍是一项挑战，同时，脑类器官的构建难度大、成本高，且不同批次构建的脑类器官之间存在异质性，导致脑类器官的构建难以再现和重复。今后仍需要不断完善脑类器官的构建方法来丰富其功能，进一步拓宽脑类器官的研究领域，推进脑类器官治疗疾病从实验室向临床的转换。