基于外泌体多miRNA表达水平构建的子痫前期风险预测模型效能分析

邓乾葆，张忠霞，王茹，许琳，罗书

子痫前期（pre-eclampsia，PE）属于妊娠期高血压疾病中常见的一类，近年来大量高龄孕妇的出现导致此类疾病发生率高于以往［1］。早期发现并及时干预是改善PE 孕产妇预后的最佳措施。但根据目前临床工作经验，国内孕产妇知识水平及家庭背景差异较大，部分患者由于对妊娠期高血压疾病的认知不足，导致疾病发现延迟，严重影响孕产妇及胎儿的健康［2-3］。外泌体是人自体细胞外囊泡释放的、与外界具有信号传导作用的介质，而微小RNA（microRNA，miRNA）是其中的重要组成部分［4］。国内外多项针对PE患者外泌体miRNA 的质谱研究均发现，多个miRNA 在PE和正常孕妇之间存在差异，提示外泌体miRNA 在预测PE 上具有一定的可行性［5-6］。本文在既往研究的基础上，基于外泌体miRNA构建PE预测模型并验证其效能，旨在为临床诊治PE提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019年6月—2021年12月于我院建档的孕妇作为研究对象。纳入标准：（1）宫内妊娠，单活胎。（2）年龄＞20 周岁。（3）孕周≤20 周。（4）孕妇及家属知情同意。排除标准：（1）既往合并明确的高血压病史。（2）既往明确肾脏疾病病史。（3）半年内服用影响血压及肾功能的药物。（4）首次孕检发现孕妇或胎儿存在严重的生理缺陷或指标异常。符合上述要求并报我院伦理委员会审核通过后（伦理号：KY20190528196），共计1 037例孕妇纳入本研究。

1.2 方法

1.2.1 随访及分组方案 所有孕妇入组建档后按照《孕前和孕期保健指南（2018）》［7］中相关标准进行常规产检，同时开展随访直至分娩。根据《妊娠期高血压疾病诊治指南（2015）》［8］中相关标准评估所有入组患者是否发生PE，并收集发生PE的时间。随访结束后将发生PE患者纳入PE组，其余纳入对照组。

1.2.2 外泌体miRNA 表达情况分析 本次检测的外泌体miRNA包括miR-125a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-203a-3p 及miR-215-5p。（1）外泌体提取。采用血浆外泌体试剂盒（美国System Biosciences 公司）提取血浆中的外泌体。于清晨抽取患者空腹静脉血5 mL至EDTA抗凝管；将采集到的血液在4 ℃下1 500×g离心20 min，去除血液中的细胞后取上清，4 ℃下13 000×g离心2 min，收集上清液，然后将样本置于-70 ℃环境保存，待样本收集完毕后统一检测。取500µL样本，加入126 µL 试剂盒内试剂，手动混匀，置于4 ℃孵育30 min，使用离心机在20 ℃条件下对样本进行离心30 min，去除上清液并向试管内加入200µL PBS，重置后获得外泌体悬液。在透射电子显微镜（TEM）对悬液内的外泌体的形态进行鉴定。采用Western blot 鉴定外泌体相关标志物CD63、TSG101 表达，内参为calnexin，所有实验使用抗体均由北京亿鸣复兴生物科技有限公司设计并提供。（2）RNA 提取。采用TRIzolTM试剂（宝日医生物技术有限公司）提取外泌体悬液内总RNA。（3）逆转录。用PrimeScriptTMRT试剂盒（宝日医生物技术有限公司）对各miRNA 进行反转录，取cDNA 作为荧光定量模板。反应条件：95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共45 个循环。（4）扩增定量。通过将cDNA、qRTPCR引物（具体见表1，由北京亿鸣复兴生物科技有限公司设计并提供）及相关酶组成qRT-PCR 反应体系后加入realtime PCR 分析仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］中进行反应，反应过程：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃44 s，共进行40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目标外泌体miRNA 相对U6 的表达量。

Tab.1 qRT-PCR primer sequences表1 qRT-PCR引物序列

1.3 观察指标 （1）患者一般资料。年龄、孕前体质量指数（BMI）、孕12周腰围、血压、孕次、饮酒史（饮酒时间超过5年，饮酒量折合酒精≥20 g/d）、吸烟史（吸烟时间超过5 年，吸烟量≥10支/d）、高血压家族史。（2）实验室检查资料。空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血小板计数（PLT）、血红蛋白（Hb）、血小板分布宽度（PDW）、平均血小板体积（MPV）、促甲状腺激素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、β-人绒毛膜促性腺激素（HCG）及外泌体miRNA 表达情况。所有静脉血均于患者首次就诊后次日清晨空腹留取标本。

1.4 统计学方法 采用Epidata 3.1 软件录入数据，采用R（4.0.5）软件分析数据。计量资料采用均数±标准差（）表示，2 组间均数比较采用独立样本t检验，计数资料用例（%）表示，采用χ2检验比较组间差异。应用Cox回归分析PE的影响因素；采用ggrisk 包构建多miRNA 风险模型，并通过受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）评估风险模型的预测能力。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访结果及一般资料比较 截至2022年10月31日随访结束，1 037例孕妇中63例失访，其中23例未完成随访，40 例相关检查资料不完全，最终完成随访974例（93.92%）。其中有65例发生PE，故最终分组为PE组65例、对照组909例。PE组年龄、孕前BMI、孕12周腰围均大于对照组，吸烟史及饮酒史比例高于对照组（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of general data between the two groups表2 2组一般资料比较

2.2 2 组实验室检查结果比较 PE 组TG、LDL-C、TC、ALT、AST、Hb、PDW、MPV 水平高于对照组，而TSH水平低于对照组（P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of laboratory test data between the two groups表3 2组实验室检查结果比较（）

Tab.3 Comparison of laboratory test data between the two groups表3 2组实验室检查结果比较（）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别对照组PE组t n 909 65 FPG/（mmol/L）5.11±1.41 5.22±1.98 0.584 TG/（mmol/L）1.89±0.47 2.05±0.72 2.558＊LDL-C/（mmol/L）3.08±0.60 3.31±1.15 2.756＊＊TC/（mmol/L）5.64±0.89 5.91±1.89 2.111＊ALT/（U/L）23.24±5.42 25.16±8.42 2.643＊＊AST/（U/L）18.41±4.11 19.75±4.31 2.524＊组别对照组PE组t PLT/（×109/L）214.59±37.01 219.36±57.39 0.961 Hb/（g/L）123.43±9.33 126.47±10.35 2.519＊PDW/%15.30±2.04 17.60±4.27 7.933＊＊MPV/fL 8.77±2.01 9.98±2.96 4.516＊＊TSH/（U/L）2.25±0.39 1.95±0.34 6.070＊＊FT3/（pmol/L）4.25±0.42 4.29±0.64 0.664 FT4/（pmol/L）12.56±1.91 12.95±3.21 1.529

2.3 2 组外泌体miRNA 表达水平比较 PE 组外泌体中miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-215-5p 水平均高于对照组，miR-125a-3p 及miR-203a-3p 水平低于对照组（P＜0.05），见表4。

Tab.4 Comparison of miRNA expression levels in different exosomes between the two groups表4 2组不同外泌体miRNA表达水平比较（）

Tab.4 Comparison of miRNA expression levels in different exosomes between the two groups表4 2组不同外泌体miRNA表达水平比较（）

＊＊P＜0.01。

组别对照组PE组t n 909 65 miR-125a-3p 1.13±0.20 0.77±0.11 14.771＊＊miR-155-5p 0.96±0.17 1.41±0.29 18.492＊＊miR-199a-5p 1.12±0.22 1.71±0.38 19.532＊＊miR-203a-3p 1.72±0.45 0.97±0.31 13.146＊＊miR-215-5p 1.21±0.31 1.40±0.25 4.802＊＊

2.4 外泌体miRNA 与PE 关系的多因素Cox 回归分析 以是否发生PE 为因变量（是=1，否=0），外泌体miRNA 作为自变量进行Cox 回归分析。结果显示，miR-125a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-203a-3p 及miR-215-5p 表达水平为PE 发生的独立预测因子（P＜0.05），见表5。

Tab.5 Cox regression analysis of multifactor correlation between exosome miRNA and PE表5 外泌体miRNA与PE相关性的多因素Cox回归分析

2.5 PE 风险预测模型的构建和应用 基于2 组外泌体miRNA 表达水平构建的风险预测模型见图1，预测模型危险评分≥-0.24时为区分危险分层的最佳截点。

Fig.1 miRNA risk prediction model based on PE multiple exosomes图1 基于PE多外体miRNA风险预测模型

2.6 PE 发生的预测模型评估 ROC 曲线分析显示，由上述外泌体miRNA构建的风险预测模型在PE发生方面具有良好的预测价值（AUC=0.998，P＜0.001），敏感度为96.92%（63/65），特异度为93.94%（854/909），见图2。

Fig.2 ROC curve of PE prediction by multiple miRNA expression risk model图2 多miRNA表达风险模型预测PE的ROC曲线

3 讨论

3.1 PE预测模型的研究现状 PE的预测模型一直以来都是产科的研究热点，既往研究使用胎盘生长因子、可溶性fms 样酪氨酸激酶-1 等特异性指标构建PE模型具有一定的可行性，但是由于上述指标特异度较差，故模型的预测效果有待进一步提升［9］。外泌体作为信号传导介质在人体内广泛存在，且伴随着基因芯片技术研究的逐步深入，国内外针对PE外泌体miRNA 的研究也取得了初步成果。本研究为避免单个miRNA受疾病或其他因素影响，故在既往研究的基础上，纳入多个外泌体miRNA作为本次模型构建的参考对象，进一步提升了预测模型的准确性［10-11］。

3.2 临床常用实验室检查指标与PE 的关系 本研究首先针对PE的一般指标进行分析，存在差异的项目中，年龄、孕前BMI、腰围、吸烟及饮酒史等在国内外指南中已被认定是影响PE发生的危险因素［12-13］。国外一项指南中对于2 次妊娠与PE 之间的关系还存在一定争议［14］，结合本次研究情况来看，二者之间并没有明显差异，但本研究中2 次妊娠人群仅占32.23%（314/974），人群基数较小，故对于此争议还需要进一步扩大研究范围以求得到更具说服力的结论。TG、LDL-C 及TC 均属于体内脂代谢指标。相关研究显示，上述3 个指标升高可能导致血管内壁炎性因子水平上升，可以间接体现血管损伤的情况［15］。同时因为血管损伤是目前PE公认的诱因，故TG、LDL-C 及TC 与PE 可能存在相关性；相关研究指出，血管内皮损伤会导致内皮素水平升高，升高的内皮素通过循环系统进入肝脏后会诱发肝脏微循环收缩，从而制造缺血缺氧环境，导致肝细胞损伤，出现ALT及AST升高的情况［16-17］。从上述过程中不难看出，ALT及AST可以部分反映血管内皮损伤程度，从而与PE 的发生风险存在正相关的关系。具有高危PE风险的孕妇因血管损伤程度逐步累积，诱发胎盘滋养层缺血缺氧加重，从而发生不可逆性损伤，而血管及胎盘滋养层的损伤修复主要依赖于血小板，这会导致血小板的大量消耗。在上述背景下，骨髓大量分化新生血小板，而新生血小板相较于成熟血小板的PDW及MPV会有一定差异，这可能是导致2组患者出现上述2 个指标差异的原因［18］。研究显示，TSH降低预示着母体甲状腺素相对不足，而孕早期甲状腺功能低下可能导致子宫螺旋动脉生长受限，后期因血供不足诱发胎盘的缺血缺氧损伤，最终导致PE 的发生，故TSH 较低的孕妇PE 发生风险升高［19］。本研究分析常规实验室检查项目的目的在于进一步了解纳入样本与既往研究之间的差异，分析是否存在可能影响研究结果的相关因素，通过结果可以看出，上述指标与既往研究结果存在相似性，说明本研究结果可重复性较好。但以上分析的实验室检查指标受到环境、饮食及生活习惯等不可抗力因素的影响较大，单次测量数据不一定能有效反映机体真实情况，故并未纳入模型构建范畴。

3.3 miRNA 与PE 之间的关系及基于miRNA 构建PE 预测模型效果分析 Hu 等［20］研究认为，高表达的miR-125a-3p可以通过结合血管平滑肌细胞上的靶标丝裂原活化蛋白激酶-1 从而达到抑制血管壁细胞分裂和生长的作用，避免血管损伤进一步加重。通过本研究发现，PE 患者miR-125a-3p 表达量较低，可以认为此类人群因缺少避免血管损伤的miR-125a-3p 会导致发病或病情进展。胞内磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）轴在人体内可以通过影响内皮型一氧化氮合酶磷酸化，从而进一步促进血管内一氧化氮及血管内皮生长因子分泌而诱发血管内皮损伤［21］。miR-155-5p 可以通过与AKT1 蛋白上的3'-非翻译区位点结合，促进AKT1表达，导致血管损伤加重，因此可以认为miR-155-5p表达情况与血管损伤之间存在相关性，可能在PE的发生及发展过程中扮演关键角色。研究显示，miR-199a-5p 可以与细胞沉默调节蛋白1 构成复合体，加重血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞衰老，加速血管损伤［22］，推测miR-199a-5p与PE之间可能存在相关性。在Han等［23］的动物模型研究中，miR-203a-3p 可以通过抑制HIF-α 及血管内皮生长因子A（VEGFA）的表达阻止糖尿病视网膜病变小鼠的视网膜血管生成。而HIF-α 及VEGFA 的高表达会导致血管内皮损伤加重，故推测miR-203a-3p 高表达可以抑制HIF-α 及VEGFA，从而减少血管内皮损伤。结合本研究结果认为，孕妇体内可能因miR-203a-3p高表达导致PE发生率降低。但上述结论来源于动物实验，尚缺少人体或细胞实验结果支撑，可以进一步开展人体或细胞学研究探究具体作用机制。miR-215-5p 可以通过刺激靶向基因CDC6 表达，在降低滋养层细胞N-钙黏蛋白和波形蛋白表达的同时，上调E-钙黏蛋白表达，达到抑制滋养层细胞分化和迁移的作用，而滋养层细胞分化及迁移能力的下降是导致PE 发生的重要因素，故miR-215-5p 升高可以导致PE 的发生［24］。本研究通过构建外泌体多miRNA 对PE 预测的模型结果显示，当模型危险评分≥-0.24 时为区分危险分层的最佳截点，ROC 曲线对PE 预测的AUC 达0.994，且敏感度及特异度均较高，因此认为可以在临床开展大规模研究验证后运用于临床PE的诊断。

综上，miR-125a-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-203a-3p 及miR-215-5p 与PE 的发生有关，以上述5 个miRNA 构建的PE 预测模型效果较好。但本研究为单中心小样本研究，且上述miRNA与PE之间的具体作用机制仍需开展基础研究进行证实。