大麦耐盐近等基因系叶片响应盐胁迫的转录组学分析

摘要：为解析大麦耐盐基因QSl.TxNn.2H响应盐胁迫的分子机制，以包含耐盐基因QSl.TxNn.2H的1对近等基因系N53（盐敏感）和T66（耐盐）为供试材料，通过转录组测序（RNA-Seq）分析对照和盐胁迫（300 mmol/L NaCl）处理120 h的近等基因系叶片中响应盐胁迫的差异表达基因，根据测序结果进行DEG筛选、GO富集和KEGG分析，并使用qPCR技术分析基因的表达水平，验证转录组测序结果。研究表明，从N53中共鉴定到6 652个DEG，其中3 348个基因上调，3 304个基因下调；T66中只鉴定到1 447个DEG，716个基因上调，731个基因下调。GO富集表明，DEG主要富集在细胞过程、代谢过程、转运蛋白活性、细胞膜等。KEGG富集表明，耐盐系T66中特异性富集激素信号转导和植物MAPK信号通路，并筛选到12个在近等基因系间差异表达的基因。使用qPCR技术分析了盐胁迫中与离子运输相关的HvHKT、HvNHX和HvVHP基因的表达水平，结果与转录组里基因表达趋势一致，验证了转录组数据的准确性。QSl.TxNn.2H可能通过调控离子相关基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表达调控大麦耐盐性。此外，在QSl.TxNn.2H定位区间内，有10个DEG，为QSl.TxNn.2H候选基因鉴定提供了参考。研究结果初步探索了耐盐基因QSl.TxNn.2H调控大麦耐盐性的分子机制，并分析了QSl.TxNn.2H定位区间内的DEG，为大麦耐盐育种提供了候选基因及理论依据。

关键词：大麦；盐胁迫；转录组；差异表达基因；KEGG富集；候选基因

中图分类号：S512.301；S512.303" 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）24-0044-09

收稿日期：2024-09-12

基金项目：江苏省高等学校大学生创新创业训练计划（编号：202411117241Y）；国家自然科学基金（编号：32301871）；省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室开放课题（编号：XZNKY-CZ-2024-02）；江苏省重点及面上项目（编号：BE2023334）；国家大麦青稞产业技术体系建设专项（编号：CARS-05）；江苏高校优势学科建设工程项目。

作者简介：李璐飞（2002—），男，山西晋中人，主要从事大麦遗传育种研究。E-mail：2711607287@qq.com。

通信作者：朱 娟，博士，讲师，主要从事大麦遗传育种研究。E-mail：007670@yzu.edu.cn。

土壤盐渍化是全球农业面临的重大挑战，世界上约20%的灌溉农田受到土壤盐渍化的不利影响^［1］，且灌溉不善、气候变化加剧了土壤盐渍化问题。我国盐碱地涉及17个省区，主要分布在东北平原、西北干旱区、黄淮海平原及东部沿海地区，严重威胁我国的粮食安全^［2］。我国约有1亿hm2盐碱地，其中约0.1亿hm2具有开发利用潜力，培育推广耐盐作物品种，是有效利用盐碱地、保障粮食安全生产的重要举措。

盐胁迫下，高浓度的Na+在细胞中积累，过量的Na+会导致K+缺失，最终产生毒害，破坏植物体内的离子稳态^［3］。因此，维持细胞质内较高的钾钠离子比，维持植物体内的离子平衡，是植物耐盐的关键^［4］。目前关于盐胁迫下植物离子平衡研究主要集中在HKT基因家族（high-affinity K+ transporter，高亲和性钾离子转运蛋白）、NHX基因家族（Na+/H+ exchangers，Na+/H+逆向转运蛋白）及VHP基因家族（vacuolar H+-pyrophosphatase，液泡H+-焦磷酸酶）。

1995年Rubio等从小麦中克隆了第1个HKT基因TaHKT2；1，进一步研究发现，HTK基因对Na+也具有转运作用^［5］。Rosario等研究发现HTK基因功能上差异与第一选择性成孔区（P-loop ）的Ser/Gly残基有关^［6］。Ser残基SGGG型，多为Na+单向转运体，而Gly残基GGGG型，多为Na+和K+同向转运体。在模式作物拟南芥中，AtHKT1可以控制Na+进入和高亲和力K+摄取^［7］。athkt1突变体的雄蕊在盐胁迫下过度积累Na+，会限制雄蕊的伸长，导致雄性不育。AtHKT1在拟南芥雄蕊的韧皮部和木质部周围特异性表达，为盐胁迫下提高植物产量提供了新策略^［8］。来自面包小麦的TmHKT1；5-A，通过增强排Na+能力，可以降低叶片中的Na+含量。在盐碱地中，与不包含TmHTK1；5-A的盐敏感系相比，含有TmHTK1；5-A的近等基因系产量可提高25%^［9］，具有较大应用潜力。大麦中HvHKT1；5具有Na+转运能力，敲除HvHKT1；5可以减少Na+从根部向地上部转移，从而提高大麦的耐盐性，不同于其他禾本科作物中的HKT1；5，HvHKT1；5负调控大麦的耐盐性^［10］。

NHX基因家族属于转运蛋白的一价阳离子/质子反转运蛋白（CPA1）家族，对维持离子稳态和pH梯度有关键作用。在拟南芥中，鉴定到6个NHX基因，主要分布在液泡和高尔基体中，与离子的转运和储存密切相关。Elias等发现拟南芥AtNHX1和AtNHX2定位在液泡，与野生型相比，nhx1/nhx2双突变体液泡的酸性pH值更高，K+含量更低，表明AtNHX1和AtNHX2对控制液泡pH值和K+稳态具有重要作用^［11］。水稻中OsNHX3受盐胁迫正向调节表达，且在叶片中的表达水平较高，可能通过控制叶片中Na+区隔化来提高水稻的耐盐性^［12］。Jabeen等通过分析盐胁迫下36份野生大麦和2份栽培大麦中HvNHX基因的表达水平，发现HvNHX1和HvNHX3在耐盐品种中的表达始终高于盐敏感品种，HvNHX1和HvNHX3的序列存在丰富的变异，西藏野生大麦独有的HvNHX1和HvNHX3等位基因可以提高大麦耐盐性，推测HvNHX1和HvNHX3是通过Na+在液泡中的隔离调节盐胁迫下离子稳态^［13］。

液泡H+泵焦磷酸酶类（VHP）为Na+在液泡中的区域化提供了质子梯度。VHP产生的电化学梯度H+可以驱动次级转运蛋白，如Na+/H+转运蛋白。液泡Na+/H+逆向转运蛋白介导的H+梯度驱动Na+向液泡运输，不仅可以减少细胞质中多余的Na+，还可以增加细胞的渗透压，因此在植物耐盐性中发挥重要作用。上调表达VHP可以为液泡中Na+的区域化提供额外的能量，并赋予转基因植物耐盐性。HVP10是大麦Nax3控制排钠的候选基因，HVP10敲除突变体Na+积累增加，耐盐性降低^［14］。

RNA-Seq是一种用于研究转录组的高通量测序技术^［15］，近年来RNA测序技术已经成为深入研究转录组复杂性的强大工具，通过对基因组序列已经探明的物种进行基因组测序，并进行基因表达差异性分析，可以发现大量的单核苷酸多态性位点（SNP）、插入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV）等，有助于理解物种的遗传多样性和进化关系^［16］。董明等通过对高粱苗期盐胁迫的转录组数据进行分析，发现高粱苗期响应盐胁迫主要受到激素信号转导和光合作用调控，且类黄酮生物合成途径在耐盐品种中发挥重要作用^［17］。刘佳月等通过对转录组数据分析，挖掘出许多离子运输、激素信号转导、代谢过程等相关的基因，为解释植物耐盐机制提供了理论依据^［18］。

大麦（Hordeum vulgare L.）是世界第四大禾谷类作物，具有食用、饲用、酿酒、保健等功能。与其他粮食作物水稻、小麦相比，大麦耐盐性强，但大麦耐盐基因挖掘进展缓慢。因此，本研究通过对1对耐盐性有差异的近等基因系进行转录组分析，在转录水平上对大麦耐盐机制进行初步研究，以期为大麦耐盐遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以包含耐盐基因QSl.TxNn.2H的1对近等基因系N53（盐敏感）和T66（耐盐）为试验材料。该近等基因系在正常生长时无明显差异，盐胁迫后，N53叶片萎蔫甚至死亡，而T66叶片持绿，无明显盐害症状^［19-20］。

1.2 供试材料培养与处理

取饱满且大小一致的N53、T66种子，用10%的次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水冲洗3遍，正常发芽后，选取露白一致的种子，于2023年11月种植于扬州大学气候室培养，培养条件设置温度15～20 ℃，12 h光照—12 h黑暗，湿度50%。播种于 3 cm×3 cm×10 cm的小黑盆中，每盆播种4粒。待大麦幼苗生长至3叶1心期进行盐胁迫处理，盐胁迫浓度为300 mmol/L的NaCl溶液，同时设置对照加入等量的蒸馏水，均设置3个生物学重复。盐胁迫4 d之前，近等基因系和对照间无明显差异（叶片健康生长，株高差异不显著），而在处理5 d时（120 h），盐敏感系N53叶片开始出现轻微盐害症状时（叶尖萎蔫）而T66无盐害表现。因此，收集盐胁迫下120 h的叶片液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存，送样至百迈客生物公司进行转录组测序。

1.3 转录组测序与数据分析

采用 Trizol法提取大麦幼苗样品的总RNA，并利用超微量分光光度计Nanodrop和生物分析仪Agilent 2100检测RNA浓度和纯度。用Oligo（dT）磁珠富集mRNA。将mRNA打断后，以其为模板合成cDNA，经磁珠纯化、末端修复及3′-末端加 A、连接接头和 USER 酶消化、PCR扩增和纯化完成文库构建，质检合格后利用Novaseq6000测序平台进行cDNA的文库测序。通过内部 Perl 脚本对FASTQ格式的原始数据进行处理，移除接头序列、Ploy-N序列和低质量序列。利用HISAT2工具软件比对，将质控数据映射到参考基因组序列，过滤出干净读数。将盐胁迫组和对照组样品测序得到的序列进行比较，基因表达水平通过FPKM （fragments per kilobase of transcript per million fragments）来估计。利用DESeq R软件包（1.10.1）进行差异表达基因分析，以Plt;0.01，绝对值 "|log2FC|gt;1.5 作为筛选差异基因的条件。之后进行GO分析和KEGG分析，筛选显著性高的差异表达基因。基因本体论（GO） 通过clusterProfiler R软件包进行富集分析；KEGG分析中通过 Kobas软件来测试差异表达基因的统计富集，使用clusterProfiler R软件包来寻找显著富集的KEGG途径。将差异表达基因分别与GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库进行比对，获得相应差异表达基因的注释信息。为确保转录组数据的可靠性，选取与大麦盐胁迫相关的HvNHX、HvHKT及HvVHP基因，进行qPCR验证。基因的编码区序列于Ensembleplants 网站 （https：//plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index）下载，根据其序列长度，使用 primer 5.0 软件设计荧光qPCR引物（表1），以大麦GAPDH（HORVU.MOREX.r3.7HG0703580）基因为内参基因，由擎科生物科技有限公司进行合成。在7500 Real-time PCR仪上进行扩增，具体程序：95 ℃ 变性2 min；95 ℃退火10 s；60 ℃延伸30 s。利用2^-ΔΔCT值，并进行定量分析。重复3次。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下大麦幼苗转录组分析

对对照（CK）和盐胁迫处理（S）下12个cDNA文库（每个样品3个独立生物学重复）进行高通量测序，各样本净读数均大于19 507 294，净数据量大于5.84 G，GC含量在53.75%～55.34%，说明高通量测序数据质量良好，数据量充足，GC含量稳定。对于二代测序，通常认为质量控制参数的标准为Q20大于95%、Q30大于85%，本研究测序结果中Q20 碱基比例大于97.48%，Q30碱基百分比大于93.80%，意味着测序数据准确可靠，满足转录组分析的要求（表2）。

将样品比对至大麦参考基因组，各样品比对基因组读数在94.94%以上，其中唯一比对读数在91.15% 以上，表明测序结果与参考基因组具有较高的相似性和一致性。唯一比对读数的比例稍低可能是由于大麦基因基因组部分序列高度保守或者是存在高GC含量区域，导致部分读数无法唯一地映射到参考基因组上（表3）。

为验证样品的可重复性，对N53和T66的12个样品进行PCA（图1）。降维之后，4个试验组的3个生物重复距离相近，重复性好。同时N53CK和T66CK样品距离相近，N53S和T66S距离远，说明N53CKY和T66CKY之间基因表达差异较小，而N53S和T66S之间基因表达差异较大。

2.2 差异表达基因（DEG）鉴定

盐胁迫与对照相比，从N53中共鉴定到6 652个DEG，其中3 348个基因上调，3 304个基因下调；T66中只鉴定到1 447个DEG，716个基因上调，731个基因下调；盐胁迫下N53和T66相比，共鉴定到 4 845 个DEG，其中2 103个基因上调，2 742 个基因下调（图2-A）。进一步对N53和T66上调和下调的差异基因进行分析，绘制韦恩图（图 2-B、图2-C），在N53和T66中，515个DEG均上调表达，455个DEG均下调表达。

2.3 差异基因GO富集分析

GO富集分析可以将DEGs分为生物学过程（biological process）、细胞组分（cellular component）和分子功能（molecular function）3个层面。对N53和T66的DEG分别进行GO富集分析。N53富集的结果显示，从生物学过程层面看，DEG以细胞过程、代谢过程、生物调控和对刺激反应为主；从细胞组分层面看，细胞解刨实体占比最多，细胞内受体其次，含蛋白质复合物最少；分子功能层面看，则以结合、催化活性、转运蛋白活动为主。T66的GO富集结果与N53相似（图3）。

进一步从3个层面进行分析（图4），N53的生物学过程在对蛋白磷酸化、热反应、蛋白质复合物寡聚化、过氧化氢反应、水反应等过程显著富集；T66的生物学过程在蛋白磷酸化、热反应、细胞表面受体信号通路、L-脯氨酸生物合成过程、对生物刺激的反应等过程显著富集。分子功能富集结果显示，N53最显著富集的6条GO是ATP结合、金属离子结合、蛋白激酶活性、氧化还原酶活性、催化活性、跨膜受体激酶活性。T66最显著富集的6条GO分别是ATP结合、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、钙离子结合、多糖结合、蛋白激酶活性和跨膜受体激酶活性。细胞组分富集结果显示，N53中的DEG在光系统Ⅱ放氧复合体、叶绿体基质、膜的外源性成分等显著富集。T66中的DEG在质膜、膜的整体成分和液泡部分显著富集。

2.4 差异基因的KEGG通路分析

为了研究在N53和T66中响应盐胁迫的生物学通路，分别对N53和T66中DEGs进行KEGG通路分析。N53的KEGG分析结果显示，最显著富集的5条通路分别是碳代谢、氨基酸生物合成、亮氨酸和异亮氨酸降解、戊糖磷酸途径和乙醛酸和二羧酸代谢。T66的KEGG分析结果显示，DEG最显著富集的5条通路分别是淀粉和蔗糖代谢、植物-病原菌互作、精氨酸和脯氨酸代谢、激素信号转导和植物MAPK信号转导通路。以上这些代谢途径可能是大麦响应盐胁迫的重要途经，其中植物激素信号转导通路和MAPK信号转导通路在耐盐材料T66中显著富集，该通路可能对提高大麦耐盐性起关键作用（图5）。

2.5 富集通路差异基因挖掘

对T66特有的植物激素信号转导通路和MAPK信号转导通路富集的DEG，以FPKMgt;1、｜log2FC｜gt;1.5、Plt;0.01为标准，筛选到78个DEG。分析78个DEGs在N53和T66中的表达水平，用log2FC绘制图6。大部分基因在N53和T66中的表达变化水平一致，但12个DEG在2个材料中差异表达，HORVU.MOREX.r3.UnG0753020、HORVU.MOREX.r3.3HG0220680、HORVU.MOREX.r3.1HG0000690、 HORVU.MOREX.r3.5HG0484690、HORVU.MOREX.r3.4HG0331910在N53中表达水平无显著变化，在T66中显著下调表达；HORVU.MOREX.r3.7HG0642890在N53中显著下调表达，在T66中显著上调表达。HORVU.MOREX.r3.6HG0561620、HORVU.MOREX.r3.3HG0273500、HORVU.MOREX.r3.2HG0188860、HORVU.MOREX.r3.3HG0304380在N53中显著上调表达，在T66显著下调表达。

2.6 qPCR验证

以FPKMgt;1、Plt;0.01、｜log2FC｜gt;1.5为差异基因标准，分析盐胁迫中钠钾离子运输关键基因HKT基因、NHX基因和VHP基因的表达水平，得到HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2、NHX7和HvVHP1.1为差异表达基因，其中HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2在N53中显著上调表达，NHX7在N53和T66中均显著下调表达，HvVHP1.1在N53中显著下调表达。

为了验证转录组数据分析的DEG的可靠性，利用qPCR验证以上7个差异表达基因，以log2FC绘制热图（图7）。差异基因的转录水平和qPCR结果趋势一致，证明了本研究数据的可靠性。也表明QSl.TxNn.2H可能通过调控离子相关基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表达调控大麦耐盐性。

3 讨论

植物的耐盐性易受环境影响 是非常复杂的数量性状^［21］。转录组测序技术的发展，为挖掘植物耐盐基因提供了高效、低成本的方法。本研究通过对1对耐盐性有差异的近等基因系N53和T66进行转录组分析，在N53和T66中分别筛选出6 652个和 1 447 个DEG，N53中3 348个基因上调，3 304个基因下调；T66中716个基因上调，731个基因下调。在盐敏感材料N53中的DEG数目显著多于耐盐材料T66，说明N53的基因表达水平受盐胁迫的影响更大。Kong等对RPY geng（耐盐品种）和Chao 2R（盐敏感品种）进行转录组分析，Chao 2R的DEG显著多于RPY geng，本研究结果与之一致。盐胁迫对盐敏感材料的基因转录水平影响更大^［22］。

DEG的GO和KEGG分析发现，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性、激素信号转导和植物MAPK信号通路在T66中特异性富集。丝氨酸/苏氨酸激酶通过磷酸化下游信号蛋白，把细胞外信号传入细胞内，影响基因转录实现多种生物学功能^［23］。PP2CA（protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha）是4种主要的丝氨酸/苏氨酸激酶之一，也是ABA信号转导通路核心负调控部分^［24］。KIM等发现水稻中OsRF1靶向OsPP2C09蛋白进行泛素化和降解，OsPP2C09蛋白的降解，使野生型对盐胁迫更加敏感^［25］。Wu等也发现过表达RGLG1可以增强PP2CA和其他可能的PP2Cs的降解，调节拟南芥耐盐性^［26］。KEGG分析富集了大量植物激素信号转导通路基因，该研究中近等基因系的DEGs也发现了大量ABA通路相关转录因子如bZIP、CBL、WRKY等，以丝氨酸/苏氨酸活性为关键的ABA信号转导通路可能对大麦盐胁迫响应有重要意义。

QSl.TxNn.2H是影响N53和T66耐盐性的关键位点，位于大麦2H上10 217 825～15 025 898 bp的区域^［27］。本研究以FPKMgt;1，｜log2FC｜gt;1.5，Plt;0.01为标准，对N53和T66该区域的DEG进行筛选，共鉴定到10个DGE（表4）。HORVU.MOREX.r3.2HG0099930编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是细胞内糖酵解途径中的关键酶，是盐胁迫下维持光合作用和植物发育的重要因子^［28］。HORVU.MOREX.r3.2HG0101890编码甲基转移基因，是盐敏感系N53中表达水平上调程度最大的基因，Hafeez等研究发现，甲基转移基因对棉属的盐胁迫、纤维发育和次级细胞壁的形成有多重反应^［29］。甲基转移基因主要参与次级代谢和代谢途径，次生代谢产物（如木质素、类黄酮、酚酸）在植物响应非生物胁迫时增加，为植物提供更好的耐受性。

4 结论

综上所述，通过对近等基因系N53和T66叶片在对照和盐胁迫下的转录组学测序分析，筛选到在近等基因系间差异表达的基因4 845个，其中2 103个上调表达，2 742个下调表达。GO及KEGG富集分析表明植物激素信号转导和MAPK信号转导通路可能是T66耐盐性调控的的关键通路。利用qPCR技术分析与离子运输相关的HvHKT、HvNHX和HvVHP基因在N53和T66叶片中的表达水平，QSl.TxNn.2H可能通过调控离子相关基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表达调控大麦耐盐性。在QSl.TxNn.2H定位区间内存在10个差异表达基因，为QSl.TxNn.2H候选基因鉴定提供了参考。

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