隧道纳米管介导线粒体转移缓解氧化应激及其在慢性阻塞性肺疾病的研究进展

杨焜 程意 郭雪君

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种常见的气道慢性炎症性疾病。截至到2019年,全球30～79岁人口慢阻肺的患病率为10.3%,患病人数约3.919亿人,大多数为低、中收入国家人群[[]]。吸烟是慢阻肺最重要的病因之一。烟草燃烧释放的烟雾(cigarette smoke,CS)中已经鉴定出4 000至 7 000 种氧化剂(reactive oxygen species,ROS)成分,包括酚类、半醌类、一氧化氮、二氧化氮、过氧亚硝酸盐等。每一口CS中约含1 015个自由基[2,3],引起全身氧化应激,尤其是进行直接接触的肺。

慢阻肺患者体内的ROS不仅源于直接吸入的CS,也由后续炎症反应产生。吸烟者肺部及全身的吞噬细胞均高于非吸烟者,且生成ROS的速度更快[3]。CS还诱导大量髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的生成。MPO已被证实与慢阻肺患者呼吸功能障碍程度相关[4]。

线粒体是参与能量代谢及维持稳态的重要结构,参与ROS生成与调节。线粒体DNA (mitochondrial Deoxyribonucleic Acid,mtDNA) 对氧化损伤易感[5]。ROS积累会影响线粒体形态与功能。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)不仅保留了多向分化潜力,还参与组织修复与免疫调节。研究证实其对氧化应激引起的细胞损伤具有保护作用。其中线粒体转移是重要的机制之一[6,7]。MSCs可以通过多种方式将线粒体转移至损伤细胞,从而改善细胞能量代谢,减少凋亡。其中隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)介导的线粒体转移是目前研究的热点之一[6,8]。

TNT是由细胞膜延伸出的突起结构[9]。直径约50纳米至200纳米,长度数微米,外观很少表现出分支,通常悬浮于培养基中,与基质无接触[10-15]。TNT是瞬态结构,寿命约几分钟到几个小时不等[11,14]。允许细胞间小分子、囊泡、线粒体甚至致病微生物交换[11]。不同种类细胞TNT结构、组成、功能、性质和形成机制具有差异[11]。F-肌动蛋白是TNT的主要组分,通常根据TNT中是否含微管将其分为两种类型[11-15]。 研究证实, MSCs通过TNT介导与CS损伤后细胞间的线粒体转移[7,16],因此在慢阻肺中具有潜在治疗作用。

一、氧化应激引起线粒体功能障碍

氧化应激参与慢阻肺的发生与发展,是CS引发慢阻肺的启动环节[2,3,17]。 ROS的积累可以引发肺泡上皮受损以及细胞外基质重塑,使得肺表面活性物质与抗蛋白酶活性减低,促进炎症介质释放与呼吸道粘液大量分泌。

ROS可以引起线粒体形态改变与损伤。气道疾病患者的气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)线粒体表现出明显的形态学缺陷,线粒体分裂与融合失衡[5]。进一步研究发现CS影响了线粒体分裂融合过程的相关基因,如磷酸酶和张力蛋白同源物诱导激酶1、 E3泛素蛋白连接酶、Ras同系物家族成员T1和动力蛋白相关蛋白1[18,19]。慢阻肺患者和CS诱导肺气肿小鼠血清中mtDNA水平升高。香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激后的细胞培养液中也发现mtDNA的释放,提示线粒体损伤。同时,DNA损伤相关标志物表达增加,包括DNA酶Ⅲ、环磷酸鸟苷-腺苷合成酶、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3、促炎细胞因子及衰老相关标志物p16和p21[20]。

二、TNT介导MSCs与细胞间线粒体转移

细胞间TNT的形成及其介导的线粒体转移在大量体外试验中发现。在对细胞、MSCs线粒体及TNT主要组分(F-肌动蛋白)进行染色后,通过荧光显微镜观察到了线粒体经TNT由MSCs转移到受体细胞[6]。利用激光扫描共聚焦显微镜发现,TNT在MSCs与人脐静脉内皮细胞中共培养4小时内形成,并且检测到了线粒体通过TNT的转移[21]。

TNT可以在MSCs与多种细胞间形成[7,13,14,22-26]。 包括支气管上皮细胞、气道平滑肌细胞、关节软骨细胞、角膜内皮细胞、神经元、T细胞、巨噬细胞等,参与机体生长发育与免疫调节。TNT还调节细胞衰老。共培养第5代(P5)与第11代(P11)MSCs后发现,相比于单独培养P11 MSCs,共培养体系中细胞存活率更高,上清中血管内皮生长因子,白介素-6分泌升高。此外,P5MSCs明显减少了P11MSCs衰老标志物p16的表达,而这种作用在使用TNT抑制剂后明显减弱。证明此过程主要通过TNT介导[27]。

三、TNT的形成与调节机制

TNT受到多种外界因素的影响。在缺氧缺血、药物、CSE等刺激下,TNT的形成率明显增高[7,16,28-30]。 说明细胞倾向于通过TNT构建网络以提高应激下存活率。

TNT的形成与调节机制目前仍处于研究中。Guy等[31]提出线粒体Rho GTP酶1(mitochondrial Rho-GTPase 1,Miro1)参与调节线粒体运动。研究发现线粒体转移效率与Miro1有关。人类诱导多能干细胞衍生的MSCs (Mesenchymal Stem Cells Derived from Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC-MSCs)较骨髓MSCs高表达Miro1,其线粒体转移效率更高。此外,肿瘤坏死因子α促进iPSC-MSC 形成TNT。进一步研究发现人肿瘤坏死因子α/核因子-κB/人肿瘤坏死因子α诱导蛋白2信号通路调节此过程[32]。使用膜联蛋白V屏蔽损伤的血管内皮细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)后,MSCs与内皮细胞间的TNT形成明显减少。说明PS结构域引导TNT的形成[21]。 p53参与星形胶质细胞和神经元之间TNT的形成。siRNA沉默p53后TNT形成抑制[33]。 线粒体转录因子A被证实参与MSCs与肺微血管内皮细胞间TNT的形成[34]。 研究发现下调MICAL2PV(神经元引导基因MICAL2的剪接异构体)可以促进TNT生成。此外,MICAL2PV与线粒体Rho GTP酶2(Miro2)相互作用可以调节亚细胞线粒体运输。单加氧酶结构域参与介导此过程[15]。

四、TNT介导的转运具有方向性

有研究认为MSCs可以通过TNT将胞质内容物转移到支气管上皮细胞中。但这种转移是单向的[35]。Wang等[9]提出了不同的见解,他们发现jurkat细胞(人T细胞急性淋巴细胞白血病细胞系)借助TNT将线粒体转移到MSCs,但很少从MSCs接受线粒体。而MSCs与关节软骨细胞间建立的TNT存在双向线粒体转移[13]。血管平滑肌细胞与MSCs共培养体系中发现TNT介导线粒体的双向转移,但仅MSCs出现促增殖效应,血管平滑肌细胞的增殖速率并未改变。因此,这种交换对不同细胞的影响相异[36]。Lou等[37]发现TNT可以在恶性细胞间或间皮细胞间形成。但并未在恶性细胞和间皮细胞间发现TNT。Matula等[38]也观察到相同的现象。脂肪来源的MSCs与jurkat细胞共培养后,仅发现jurkat细胞间形成TNT结构。

关于TNT介导物质转运的方向性目前仍有争议,需要进一步深入研究。

五、TNT介导的治疗作用

大量动物和临床研究证实了MSCs在慢阻肺中的治疗作用,线粒体转移是潜在机制之一[18,39]。使用iPSC-MSCs 与骨髓MSCs治疗CS暴露大鼠,可以改善肺结构,缓解CS暴露引发的气道纤维化。体外研究证实了MSCs与支气管上皮细胞间TNT样结构的形成,通过流式细胞荧光分选证实了细胞间线粒体转移。而这种转移在应用TNT抑制剂后受到阻断。此外,研究证实TNT介导的线粒体转移效率具有细胞特异性,iPSC-MSCs转移能力更强[16]。直接共培养iPSC-MSCs与ASMCs,先观察到了iPSC-MSCs线粒体转移,后观察到了ASMCS线粒体转移。这种转移在烟草刺激存在下增强。直接共培养缓解了烟草刺激后ASMCs线粒体ROS生成、细胞凋亡及Ψm损失。而使用MSCs条件培养基或Transwell共培养ASMC等非直接共培养仅见线粒体ROS生成减少。体外实验证实iPSC-MSCs可以减少ROS生成及Ψm损失从而缓解线粒体功能障碍,减低气道高反应性,肺泡灌洗液中的炎细胞数量明显减少,并且证实了iPSC-MSCs对肺部炎症的缓解[7]。

TNT不仅介导线粒体转移,还可以影响细胞旁分泌。小鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CM)和人多能脂肪衍生干细胞(human multipotent adipose derived stem cells,hMADS)共培养后发现:CM对hMADS的旁分泌有影响作用。使用痛苦状态小鼠的CM模拟心肌梗死,与hMADS共培养后发现培养液中多种细胞因子含量变化。其中人血管内皮生长因子、人肝细胞生长因子、单核细胞趋化蛋白3和人基质细胞衍生因子1α等心脏保护因子在应用TNT阻断剂后减少。从而支持TNT对这些细胞因子的刺激作用[40]。

六、结语

线粒体转移参与多种生理、病理活动,是生物界普遍存在的现象。由于氧化与抗氧化失衡,慢阻肺患者体内ROS堆积,引发线粒体损伤,导致细胞能量代谢障碍及稳态失衡。TNT介导MSCs与细胞间线粒体转移,可以恢复细胞正常生理功能,从而缓解疾病进展。在治疗慢阻肺中具有潜在应用前景。