快速现场评价技术在重症监护室的应用进展

董阿静 赵丹萍 李海波

快速现场评价(rapid on site evaluation, ROSE)技术是一种床旁快速检测手段,是指通过穿刺、刷检、钳夹、针吸等方法于靶部位取材,然后将部分取材进行快速制片、染色后,由细胞病理学医师在显微镜下观察,根据细胞学特征进行现场快速标本充分性和初步诊断评估,综合多学科知识如:病理学、细胞学、临床微生物学等,并结合患者临床信息,将疾病和患者整体状况加以解释并指导临床,最终将剩余标本以合适渠道送入不同跟进检查环节。ROSE技术主要包括两大部分:快速现场细胞学评价(cytological ROSE,C-ROSE)和快速现场微生物学评价(microbiological ROSE,M-ROSE)[1]。C-ROSE主要用于介入操作中,评价取材满意度及实时指导介入操作,是所有后续检测的快速质量控制手段;M-ROSE可以提供部分微生物病原的形态学依据,细胞分类与计数及其比例等细胞学背景,有极高的重复检查次数,因此可用于感染性疾病,进行病情的评估和疗效的预判。

重症肺炎是指除肺炎常见呼吸系统症状外,尚有呼吸衰竭和其他系统明显受累,其可表现为社区获得性肺炎、医院获得性肺炎或呼吸机相关性肺炎,是重症监护室(intensive care unit,ICU)的常见病,及时和充分的抗菌治疗对于重症肺炎危重患者的良好预后至关重要,也是国际肺炎管理指南的重点[2],而确定病原体对于重症肺炎危重患者的抗生素管理至关重要。然而,在很多患者中确定病因是很困难的,尤其是既往有慢性基础疾病、接受过抗生素治疗和机械通气的患者中。目前,临床常用的病原检测方法有一定局限性,如病原培养存在阳性率低、时间长的缺点,再加上临床医师对目标病原的判断水平不一,均有可能导致临床用药不够精准,从而影响疾病的早期诊治。近年来,随着基因组学技术的飞速发展,宏基因组二代测序技术被越来越多地运用到感染性疾病的病原检测上,但其应用于感染性疾病的诊断还处于起步阶段,还存在耗时长、成本高、错误率高以及生物信息分析软件不够丰富等缺点。

近年来,越来越多的研究报道ROSE技术在肺部感染性疾病的诊断中发挥着重要作用,本文主要综述了ROSE技术的最新研究进展,并探讨M-ROSE与肺部感染性疾病的相关研究,分析M-ROSE应用于ICU的临床价值。

一、C-ROSE

1981年,Pak等[3]首次将现代C-ROSE应用于临床。1993年开始出现了有关C-ROSE的系统研究和Meta分析,Austin等[4]对55例怀疑患有肺癌的患者进行了细针穿刺针吸活检,结果有 ROSE指导的操作其阳性率为 100%,而没有 ROSE指导的操作其阳性率仅有 80%,该研究证实ROSE可以提高手术操作的阳性率并减少无谓的手术操作,从而减少操作相关并发症。

随着介入技术的快速发展和广泛应用,以及快速染色制片技术的发展,ROSE的临床价值得到了进一步体现,广泛应用于机体呼吸系统、生殖系统以及消化系统等各个系统实体肿瘤病变的辅助诊断。

Xu C.H.等[5]探究了支气管内超声经支气管肺活检(endobronchial ultrasound transbronchial lung biopsy with guide sheath,EBUS-GS-TBLB)联合ROSE对周围型肺癌的诊断价值,纳入了138例接受EBUS-GS-TBLB治疗并最终诊断为肺癌的患者,分为ROSE组和非ROSE组,比较有无ROSE的EBUS-GS-TBLB的诊断率、活检次数、并发症、细胞病理诊断费用及手术次数,研究结果提示,ROSE组和非ROSE组诊断率分别为87.8%和78.1%,ROSE组活检次数、手术次数及并发症发生率均显著低于非ROSE组,且ROSE组细胞病理诊断费用低于非ROSE组,均有统计学意义。马祯一等[6]探讨了ROSE评估联合细胞蜡块对乳腺癌检查的意义,实验分为C-ROSE研究组和对照组,两组各30例患者,实验结果显示C-ROSE组阳性为28例(93.33%),阴性为2例(6.67%);对照组阳性19例(63.33%),阴性11例(36.67%),其中11例阴性穿刺涂片与常规病理结果对照发现,有8例(72.73%)常规病理结果为阳性,3例(27.27%)为阴性。实验结果提示ROSE联合细胞蜡块对乳腺肿块进行定点穿刺,可提高穿刺成功率,保证穿刺质量,还能准确鉴别乳腺肿块良恶性,不但可以提高诊断准确率,还对临床靶向治疗及预后评估都有极重要的应用价值,值得推广及研究。Tamura T.等[7]研究了内镜超声引导下细针抽吸(endoscopic ultrasonography-guided fine-needle aspiration,EUS-FNA)联合ROSE对胃肠粘膜下肿瘤诊断的准确性,并与单独EUS-FNA进行比较,研究表明,EUS-FNA联合ROSE对胃肠粘膜下肿瘤诊断的准确性显著增高,且在有ROSE的病例中,胃肠粘膜下肿瘤的总体诊断准确率显著高于没有ROSE的患者,ROSE对胃肠粘膜下肿瘤的诊断能力的提高一定程度上可归因于获得了足够的免疫染色材料,且ROSE并未增加手术所需的时间。因此,ROSE联合介入是诊断机体实体肿瘤有效和安全的方法且不会增加操作的并发症。

二、M-ROSE

由于呼吸疑难病及危重症感染早期诊治的迫切需求,以及ROSE技术的广泛应用和不断更新发展,近年来,ROSE在诊断下呼吸道感染病原体方面的临床价值逐渐被报道,广泛应用于肺部感染性疾病的评估。M-ROSE的主要临床价值包括:根据形态学特征,初步辨别部分微生物病原,如念珠菌属、曲霉菌属、耶氏肺孢子菌、隐球菌和其他类型真菌、病毒包涵体、球菌和杆菌;可现场实时反复取材,保证标本量;根据细胞分类与计数及其比例等细胞学背景,粗略区分感染性疾病和非感染性疾病,从而制定初步治疗的策略,并能够预估病情严重程度和预判疗效。

1. 理论基础

感染性疾病的细胞学所见,因病原体不同或病程阶段不同而有所差异。ROSE通过恰当的染色,可以直接观察到某些细菌、真菌等,为快速确定病原微生物提供形态学依据,但在很多感染病例,尤其是细菌、病毒或非典型菌感染病例中,单一的现场快速染色法并不能显示病原菌,可组合运用不同的染色方法予以鉴别[8]。ROSE的常规染色方法首推Diff-Quick染色,染色后可以直接从镜下观察细菌的形态进行判断,如球状、杆状、螺旋状等;真菌快速荧光特异性染色可以直接在镜下判读部分真菌的菌属,如白色念珠菌、曲霉菌等;结核的特异抗酸染色可以直接镜检找到结核杆菌进行诊断用药。有些特殊病原菌需要特殊染色方法或实验室悉心培养才能显现,而这些工作并不能够在现场快速完成。

ROSE不仅可以提供微生物生态学,还可以提供明确的细胞学背景[9],比如化脓性炎症会有大量的中性粒细胞,异形增生则提示肿瘤,肉芽肿病变镜下主要成分有淋巴细胞、上皮样组织细胞、巨噬细胞和肉芽组织,而多片无细胞、无固定形状的碎片则提示结核分枝杆菌感染等。根据细胞分类与计数及其比例等细胞学背景,粗略区分感染性疾病和非感染性疾病,从而制定初步治疗的策略,并能够预估病情严重程度和预判疗效。

2. 细菌感染

大多数常见细菌在呼吸道细胞学标本的快速染色中并不易见,因为大部分细胞并不发生任何特殊的细胞病理学改变,细胞病理学的作用是很有限的。但ROSE在某些感染中却是有助于诊断的,如结核杆菌、诺卡氏菌、放线菌和军团菌等。国内一项病例报道[10],男性患者,CT提示两肺多发结节灶,恶性病变不能排除。头孢噻肟(后改头孢地尼口服)联合伏立康唑治疗1月,患者咳嗽咳痰症状加重,伴发热,胸闷气促,复查胸部CT 病变未明显吸收。行支气管镜超声导向鞘引导的经支气管肺活检取出的组织样本即刻行ROSE,ROSE 提示:显微镜下可见到大量细菌菌团及中性粒细胞,考虑放线菌感染。调整治疗方案,改用大剂量青霉素制剂治疗。经过2周治疗,患者体温正常,呼吸道症状明显好转,进一步复查胸部CT,肺部病灶显著吸收。

Li T.等[11]分析了10例最终诊断为铜绿黏液假单胞菌的支气管扩张患者,比较M-ROSE与痰菌培养的准确性和时间。由于黏液层涂层,铜绿黏液假单胞菌迪夫染色后显微镜下显示出独特的浅紫色生物膜,可以通过ROSE快速识别。该研究表明M-ROSE与病理的符合率为100%,其除了具有较高的准确性外,完成诊断的时间比细菌培养缩短了1000多倍。需要强调的是,ROSE不同于快速病理诊断,病理诊断的目标是明确诊断、精确诊断,而ROSE着眼于细胞学背景,结合其他临床信息,协助鉴别诊断,为后续选择检查项目提供细胞学背景信息及评估标本的充分性。秦田田等[12]进行了ROSE联合二代测序在呼吸道感染中的应用研究,在支气管镜操作中通过ROSE对标本充分性和合格率进行初步判断,将ROSE阳性标本送二代测序,提高了二代测序的阳性率,进而快速精确的获得病原学依据,精准地指导抗感染治疗,减少了二次检查率,临床价值高,值得推广。

3. 真菌感染

真菌感染形成肉芽肿或化脓性肉芽肿,纯粹的化脓性变多见于有免疫缺陷者。大多数种类的真菌可在Diff-Quick、Papanicolaou 、Giemsa或真菌荧光染色中显影,可见大量负像或不同程度染色的真菌。国内一项研究[13]运用ROSE诊断儿童侵袭性肺真菌病,12例不明原因肺不张患儿,经支气管镜行病灶部位粘膜刷检再经迪夫染色后进行ROSE诊断,结果ROSE诊断为儿童侵袭性肺真菌病4例,4例ROSE结果均与二代测序及病理组织检查结果一致。王汉生等[14]探究了ROSE在经皮肺穿刺活检中诊断肺隐球菌病的准确性和时效性,研究结果提示ROSE诊断肺隐球菌病的敏感度、特异度、准确率分别为80.0%、100.0%、80.0%;ROSE和病理报告出具平均时间分别为(10±1)min、(81±1.4)h,诊断费用分别为220元、450元。因此,将ROSE应用于隐球菌的诊断,有利于缩短确诊时间并及时使用抗菌药物,为患者治疗赢得时间,值得在呼吸介入领域推广应用。叶玲等[15]通过对比肺隐球菌病患者的诊治过程,探讨M-ROSE联合肺活检对疑诊肺隐球菌病的诊断价值,该研究通过总结分析了4例肺隐球菌患者的诊断和诊治经过,表明ROSE技术在肺隐球菌病理诊断中具有快速准确的优势,优于隐球菌荚膜抗原的检测,临床意义重大。

临床上存在一些误诊的情况,ROSE可以起到辅助鉴别诊断的作用,为进一步检查提供方向。根据ROSE的结果,将标本送病理检查或送微生物室,选用适当的培养方法,进行PCR、特殊检测或耐药实验。马卫红等[16]的一项病例报告中ROSE促进了马尔尼菲青霉菌感染的诊断。一例肾移植患者初步临床和影像表现高度怀疑肺癌,在超声引导下经支气管细针抽吸,床旁进行ROSE涂片显示未见恶性细胞;在风干载玻片上的ROSE检测中发现了大量生物体。根据其特征形态怀疑马尔尼菲青霉菌,后将ROSE结果传达给微生物团队,并建立了适合马尔尼菲青霉菌的特殊培养条件,证实患者为真菌感染,进行抗真菌治疗后患者完全康复。本病例展示了ROSE在提供初步诊断方面的重要作用,从而对有限的检验标本进行分类以进行辅助检查。

4. 支原体感染

肺炎支原体肺炎是由肺炎支原体感染引起的非典型肺炎,重症肺炎支原体肺炎及难治性肺炎支原体肺炎越来越多,临床早期诊断和治疗有助于患儿预后。目前检测肺炎支原体的方法较多,但是尚没有方法能早期快速诊断肺炎支原体感染。卢瑞华等[17]总结了41例儿童肺炎支原体肺炎的M-ROSE表现,研究结果显示肺炎支原体肺炎患儿的ROSE细胞学表现有其特异性,主要表现为具有坏死性炎的特性,可见单核细胞为主的多种炎症细胞的浸润,表明ROSE对于肺炎支原体肺炎的诊断及治疗有着重要的参考价值。

三、M-ROSE在重症监护室的应用现状

下呼吸道感染病原菌的确定有赖于微生物学结果,微生物学检查的标本可来自痰、肺组织、支气管肺泡灌洗液、血及胸腔积液等[18]。支气管肺泡灌洗液通过支气管镜直接采集肺部病灶处分泌物,是用纤维支气管镜在选定的支气管肺段内的楔形位置进行的,避开了口咽部大量定植菌的污染,使标本合格率及病原菌检出率均显著提高。有研究表明,支气管肺泡灌洗液培养结果灵敏度与特异度均较高,分别为70%～90%和 80%～100%[19]。

Tao Y.等[20]在呼吸重症监护室(respiratory intensive care unit ,RICU)进行了一项回顾性研究,将患者是否床旁使用M-ROSE指导治疗分为M-ROSE组和非M-ROSE组,M-ROSE组通过M-ROSE对支气管肺泡灌洗液进行快速的细胞学和病原学分析,然后基于所有临床信息和M-ROSE结果选择抗生素,非M-ROSE组仅基于所有临床信息。研究结果提示在M-ROSE组患者入院后炎症指标下降明显快于对照组,使用抗生素种类明显多于对照组。在有创机械通气患者中,M-ROSE组病死率明显低于对照组,M-ROSE结果与二代测序结果的符合率为66.2%,高于其他实验室结果的符合率。此外,M-ROSE报告的速度明显快于培养和二代测序结果。该研究表明在RICU中使用M-ROSE有助于病原微生物的早期和快速诊断,指导危重患者的抗生素治疗方案,改善疾病进展,降低有创机械通气患者的死亡率。

刘翔腾等[21]探讨了ROSE技术在儿童重症监护病房(pediatric intensive care unit,PICU)指导儿童重症肺炎支气管肺泡灌洗的后续诊疗价值,将患者分为单纯灌洗组、灌洗+ROSE组以及家属均不同意灌洗和ROSE组。分析3组患儿治疗前后的血气、炎症指标及应用价值指标,结果显示在PICU内ROSE指导重症肺炎患儿行支气管肺泡灌洗后续诊疗,能减少抗生素的使用天数及种类,减少真菌定植率,可为抗生素的合理应用提供参考。

四、总结及展望

ROSE技术的真正优势在于快速-床旁即可实施,此外,ROSE能在一定程度上区分感染、定植还是标本污染的问题;在形态学方面,M-ROSE基本能看到细菌、真菌,尤其对真菌诊断准确率非常高,有经验的医生第一时间对细菌和真菌进行床旁诊断;而且根据细胞学背景可以对患者病情的严重程度进行评估以及判断患者目前治疗方案的疗效。目前,ROSE在ICU的应用及研究较少,而重症感染的诊断需要快速、个体化及精确度,但检验系统是无法做到的。ROSE与临床一线相结合,有望打破重症患者经验性治疗越治越重,耐药菌越治越多的死循环状态,实现早期快速精准诊断的个体化治疗,因此,在ICU中ROSE有一定的应用前景,值得进一步研究和推广。