苯扎贝特通过AKT/mTOR 通路抑制肺腺癌糖酵解机制研究

李智斌，叶锦霞，巫艳，王桂平

（广州卫生职业技术学院，广东 广州 510450）

肺癌是我国以及全球范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康和生命[1-2]，其中肺腺癌是主要肺癌病理类型，发病率约占肺癌的30%～50%。目前，临床普遍采用外科治疗、放射治疗和化学治疗等多学科综合治疗方法对肺癌进行治疗，而对于肿瘤已经转移不能进行手术切除的患者，化学治疗仍是最主要的治疗手段。当前，肺腺癌的治疗药物主要涉及铂类、第三代细胞毒药物（吉西他滨、紫杉醇、培美曲塞等）、EGFR-TK抑制剂、EGFR 单抗等[3]。然而，绝大多数肺癌患者的预后仍然十分不理想，总体5年生存率仅为10%～15%左右。

苯扎贝特（bezafibrate）是临床常用的一种贝特类降脂药。本团队前期研究发现，苯扎贝特可有效抑制肺腺癌细胞生长。体外实验发现苯扎贝特可有效抑制肺腺癌细胞生长，荷人肺腺癌细胞裸鼠体内实验也显示苯扎贝特可抑制移植瘤生长[4-5]。前期工作还证实了苯扎贝特或联合顺铂可有效抑制HIF-1α的表达，从而抑制肺腺癌的生长[6]。而前期生物信息预测揭示，该药可能通过调控PI3K/AKT/mTOR 信号通路，发挥抗肺腺癌作用。HIF-1α是PI3K/AKT/mTOR 下游重要因子，mTOR 活化后可上调HIF-1α表达，从而调控糖酵解过程。苯扎贝特可能是通过激动PPARα 受体通路，抑制PI3K/AKT/mTOR 途径功能，逆转肺腺癌瓦博格效应（Warburg effect），纠正肿瘤组织异常的物质代谢，发挥抗肺腺癌作用。目前关于苯扎贝特的抗肿瘤机制尚不清楚，本文通过细胞功能、代谢、蛋白水平，利用细胞活性检测、WB 等技术观察苯扎贝特对肺腺癌细胞的作用，探讨该药治疗肺腺癌的分子机制，为发现新的肺腺癌治疗药物提供依据。

1 材料与办法

1.1 细胞

人非小细胞肺癌细胞A549 株购自中国科学院细胞库，解冻复苏、重悬后接种在RPMI Medium1640培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和链霉素）中，置细胞培养箱进行培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 主要仪器与试剂

TD5K-Ⅱ台式低速离心机（长沙东旺实验仪器有限公司）；BDS400 倒置生物显微镜（奥特光学仪器有限责任公司）；SW-CJ-1FD 洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；3111 型CO2培养箱[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；液氮生物容器（四川亚西机器有限公司）；Multiskan FC 型酶标仪[赛默飞世界尔（上海）仪器有限公司]；BG-Power 600i 电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；JY92-IIN 超声仪细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

苯扎贝特（质量分数≥98%）、二甲基亚砜（质量分数≥99%）[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]；RPMI Medium1640 培养基、DMEM 培养基、胰蛋白酶、青霉素-链霉素[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；葡萄糖（GLU）试剂盒、乳酸（LD）测试盒（南京建成生物工程研究所）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；磷酸酶抑制剂、BCA 法蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物发展有限公司）；RIPA 裂解液、一抗稀释液（碧云天生物）；AKT、mTOR 和PKM2 一抗（美国Proteintech Group）；GAPDH二抗（美国Proteintech Group）。

1.3 细胞毒性试验

取对数生长期的A549细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度至4×104/mL，以100 µL/孔接种到96 孔培养板中，置于37 ℃、5%（φ）CO2的培养箱中培养24 h。设苯扎贝特组（25、50、100、200、400µmol/L）、阴性对照组（加入完全培养基）、空白对照组（不加入细胞），每组设5个复孔。分别于加药48 h 和72 h 后，取出培养板，每孔加入CCK-8 溶液各10 µL，继续培养1 h，在酶标仪450 nm处检测各孔的吸光度值（A）。

1.4 葡萄糖含量测定试验

按“1.3”细胞毒性实验中的细胞分组，取经药物作用72 h后的细胞悬液，1 000 r/min离心10 min后，弃上清液，留细胞沉淀，用等渗缓冲液清洗，1 000 r/min离心10 min，弃上清，留细胞沉淀；加入适量匀浆介质进行匀浆，冰水浴条件下超声粉碎，按试剂盒操作顺序加入相应试剂，用酶标仪测定各孔于波长340 nm 处的吸光度值；按试剂盒计算公式计算得到各样品对应的葡萄糖含量[7]。

1.5 乳酸含量测定试验

按“1.3”细胞毒性实验中的细胞分组，取经药物作用24 h 后的细胞液，稀释后，按乳酸测试盒说明书配制酶工作液，并准备空白管（蒸馏水20µL+ 酶工作液1 mL + 显色剂200 µL）、标准管（3 mmol/L标准品20µL+酶工作液1 mL+显色剂200µL）和测定管（待测样品20µL+酶工作液1 mL+显色剂200 µL），混匀，37 ℃水浴准确反应10 min 后，每管加入终止液2 mL。在酶标仪530 nm 处检测各孔的吸光度值，用空白管调零，测定各管的吸光度值。按试剂盒计算公式计算各管乳酸含量。

1.6 Western blot检测蛋白表达

取对数生长期的A549细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度至4×104/mL，以100 μL/孔接种到96 孔培养板中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。加入苯扎贝特试液（100、200、400 µmol/L），对照组加入不含药物的培养基，培养48 h。以PBS 洗涤2 次，每孔加入100 μL含1% PMSF（100 mmol/L）和1% Cocktail 的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min；裂解完后于4 ℃下14 000 r/min 离心5 min，收集上清液；采用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，于95 ℃煮沸10 min 进行蛋白变性。蛋白样品经凝胶电泳分离，电转至PVDF 膜。加入5% 脱脂奶粉溶液于室温封闭2 h，TBST洗膜8 min，1次；分别加入AKT、mTOR和PKM2 抗体于4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入Rabbit Anti-Mouse IgG（H+L）-HRP（1∶10 000），于室温孵育50 min～3 h；TBST 洗涤3 次，按试剂盒说明书进行显影曝光。采用Image J 软件对蛋白灰度值进行分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 苯扎贝特对肺癌A549细胞的体外抑制作用

结果见表1。苯扎贝特对肺癌A549 细胞有明显抑制作用，在相同时间组内，随着苯扎贝特用药浓度的升高，细胞抑制率也逐步增加，由此可得，苯扎贝特对A549 细胞的抑制作用随浓度增大而增大，48 h 的IC50值为453.30 μmol/L，72 h 的IC50值为439.67 μmol/L；而在相同用药剂量组内，72 h 给药组较48 h 给药组细胞抑制率稍高，但差异无统计学意义。

表1 苯扎贝特干预后A549细胞抑制率Table 1 Inhibition rate of A549 cells after bezafibrate intervention()%

表1 苯扎贝特干预后A549细胞抑制率Table 1 Inhibition rate of A549 cells after bezafibrate intervention()%

与0µmol/L比较：**P＜0.01。

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2.2 苯扎贝特对肺癌A549 细胞有氧糖酵解水平的影响

由表2结果可知，随着苯扎贝特浓度增大，细胞中葡萄糖含量不断增加，乳酸含量不断降低。由于各孔为平衡孔，即细胞初始数量、葡萄糖初始含量及乳酸初始含量一致，该结果表明，在用药过程中，随着苯扎贝特浓度升高，细胞内葡萄糖的消耗量不断减少，乳酸产量不断降低。

表2 苯扎贝特干预后A549细胞葡萄糖含量及乳酸含量Table 2 Glucose and lactic acid content in A549 cells after bezafibrate intervention()c/(mmol·L−1)

表2 苯扎贝特干预后A549细胞葡萄糖含量及乳酸含量Table 2 Glucose and lactic acid content in A549 cells after bezafibrate intervention()c/(mmol·L−1)

与0µmol/L比较：**P＜0.01。

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2.3 苯扎贝特对肺癌A549细胞蛋白表达量的影响

结果如图1 及表3 所示。结果表明，苯扎贝特干预A549 细胞48 h 后，随着药物浓度的升高，AKT、mTOR和PKM2的表达均有不同程度的降低，其中mTOR 蛋白下降较为明显，且均呈现浓度依赖性。

表3 苯扎贝特干预后A549细胞相关蛋白表达量Table 3 Expression of related proteins in A549 cells after bezafibrate intervention

3 讨论

项目组前期基于基因表达谱药物发现途径，筛选到多种肺腺癌候选治疗药物，并通过体内体外实验证实一种PPARα 受体激动剂——苯扎贝特具有较好的抗肺腺癌作用[8]。本文细胞毒性实验结果与前期研究结果一致，证明了苯扎贝特可抑制肺腺癌细胞增殖。

正常细胞在常氧条件下，主要是通过氧化磷酸化的方式产生ATP，提供自身所需的能量，而在肿瘤细胞中，即使是常氧条件下，肿瘤细胞仍然优先利用糖酵解途径提供能量，其典型特点就是葡萄糖的摄取增加以及乳酸生成增加，这就是著名的瓦博格效应[9]。苯扎贝特抗肿瘤作用的确切机制仍不清楚，而代谢异常是肿瘤发生的重要原因，逆转“瓦博格效应”的药物开发是当前肿瘤研究的焦点[10-11]。本研究考察了使用不同浓度的苯扎贝特对A549 细胞糖酵解的影响，结果显示，苯扎贝特对A549 细胞的葡萄糖摄取及乳酸生成有明显的抑制作用，且抑制作用随给药浓度升高而增强，苯扎贝特具有一定的抑制A549 细胞有氧糖酵解的效应，提示肺腺癌A549 细胞凋亡机制可能与苯扎贝特下调糖酵解途径，逆转瓦博格效应有关。

多篇文献报道AKT/mTOR 信号通路[12]及丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）[13]与肿瘤细胞的糖酵解进程有关。本研究发现，苯扎贝特处理A549 细胞会降低AKT、mTOR 和PKM2 的蛋白表达。由此，本研究推测苯扎贝特可能通过调控AKT/mTOR 信号通路及PKM2，抑制A549 的糖酵解途径，逆转瓦博格效应，从而产生抗肿瘤作用，但其对肺腺癌细胞的抑制机制还有待进一步研究。