染色体微阵列分析和全外显子组测序在产前罕见疾病诊断中的应用

李永丽,李华锋

(临沂市妇幼保健院,山东 临沂 276000)

近年来,随着分子生物学技术的发展,以染色体基因芯片和全外显子组测序为代表的高通量基因组检测技术正快速被应用于遗传性罕见病的诊断[1]。染色体微阵列分析(Chromosomal microarray analysis,CMA)又称基因芯片技术,是检测拷贝数变异(Copy number variation,CNV)引起罕见病的有效手段。全外显子组测序(Whole-exome sequencing,WES)是目前单基因遗传病确诊的重要手段,但由于有限的产前表型信息,对次要发现解释的困难以及检测费用昂贵、技术耗时的性质,推迟了WES在产前胎儿异常基因诊断中的应用,相关研究数据较少。本研究采用CMA对高危孕妇进行检测,分析致病CNV的变异和类型,对CMA检测阴性者建议进一步行WES检测,探讨二者在产前罕见疾病诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月—2023年10月来本院医学遗传科就诊的4845例孕妇,年龄15～50岁,平均(31.25±5.66)岁;孕16～34周,平均(20.93±4.65)周。纳入标准:具有产前诊断指征;均接受详细的遗传咨询;行羊水、绒毛CMA检测。风险指征包括:血清学筛查风险增加、高龄产妇、超声异常、无创产前检查(NIPT)异常、夫妇核型异常、产科病史等。本研究经医院伦理委员会审批,孕妇签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1DNA提取 行羊膜腔穿刺术抽取羊水或通过绒毛活检术采集绒毛,从绒毛、羊水中采用天根DNA提取试剂盒提取基因组DNA,严格按照试剂盒说明书操作。DNA备份用于WES检测。同时采集胎儿父母外周血提取DNA用于基因位点验证。

1.2.2染色体微阵列分析 实验反应流程参照Affymetrix公司提供的实验操作流程。实验采Affymetrix CytoScan750K Array芯片,选用GeneChip3000 Scanner 7G进行扫描,ChAS3.2 软件用于阵列图像分析。所有CNV均参照美国国家生物技术信息中心人类基因组GRCh37(hg 19)版本进行描述,并与本地数据库和在线公共数据进行深度的检索和判读。根据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)对CNV的判读进行致病性分类。CMA检测阴性者选择行WES检测。

1.2.3全外显子组测序 使用靶向捕获技术及高通量测序进行WES分析。OmniSeek®探针进行全外显子捕获,Illumina测序平台进行高通量测序,测序数据质控后经bwa软件比对、GATK软件检测变异后,用Flash Analysis在线软件系统进行变异过筛及解释。将WES所测得的可疑致病突变在父母中进行Sanger测序,以验证WES结果的准确性。根据ACMG指南进行基因变异致病性分类。

2 结果

2.1CMA检测情况 4845位孕妇样本中,4683例为羊水样本,159例为产前绒毛样本。其中2例因样本母血污染、1例DNA纯化浓度过低检出失败,其余4842例样本全部检测成功。共检测出染色体异常537例,检出率为11.09%(537/4842),经分析明确致病性变异的为370例,包括非整倍体214例,致病性CNV 134例和部分CNV嵌合22例。非整倍体检出情况见表1。CNV相关疾病主要涉及1q21缺失综合征(7例)、DiGeorge 综合征(6例)、17q12缺失综合征(6例)、Cri-du-chat综合征(5例)、16p11.2缺失综合征(5例)。详见表2。

表1 CMA检测214例染色体非整倍体

表2 CMA诊断的微缺失/微重复综合征

2.2WES检测情况 68例孕妇在CMA检测阴性的基础上进一步行WES检测,其中13例胎儿诊断出基因变异,阳性检出率为19.12%(13/68),其中3例为新发变异,7例遗传父母变异,3例遗传模式未知。检出的基因变异相关的常染色体隐性疾病5例,主要为TH、MYH3、FKTN、RYR3、SMPD1基因;检出X连锁隐形遗传病3例,主要为KDM5C、MED12和P1CAM变异;检出常染色体显性遗传病5例,主要为CIC、PTCH1、FBN2、PKD1、FGFR3基因,其中4例均为产前超声结构异常,1例为不良孕产史。随访后,9位孕妇选择终止妊娠,其余选择继续妊娠。见表3。

3 讨论

由于遗传性罕见病可能与所有类型的遗传变异有关,包括非整倍体、单亲二体、CNV和基因内突变,因此检测方法也多种多样。传统的产前细胞遗传学分析是检测染色体核型异常的一线方法。但在过去的10年里,CMA越来越多地被用于产前诊断中检测亚显微致病性CNV变异。本研究中,CMA的阳性检出率为11.09%,其中明确致病性的CNV为7.64%,经分析CMA检测出染色体非整倍体214例,检出致病性CNV134例,部分CNV嵌合22例。CNV异常相关疾病检出最多的为1q21缺失综合征,其次为DiGeorge 综合征、17q12缺失综合征、Cri-du-chat综合征、16p11.2缺失综合征等。此外,CMA在发现有临床意义的基因组CNV的同时也检测出3.45%的意义不明确变异。

随着分子诊断技术的进步,高通量测序技术也被应用于产前诊断中进行罕见疾病的诊断。目前,WES主要应用于超声诊断结构异常的胎儿产前诊断,能成功诊断3.6%～6.2%的孤立超声结构异常和14.3%～16%的有多器官系统影响的胎儿[2]。在本研究中,48例产前表型为胎儿超声结构异常,检出结构异常表型和基因型相关的有2例,其中1例胎儿临床表现为脑畸形、脑积水,WES检测出FKTN纯合变异相关的Walker-Warburg综合;1例胎儿产前超声检测出四肢短小,WES检测出FGFR3杂合变异,可引起严重软骨发育不全伴发育迟缓及黑棘皮症。许多孟德尔遗传疾病没有已知的产前表型,且胎儿产前表型获得的信息有限,某些胎儿产前表型与检测出临床表型没有明显的相关性,但提示胎儿患病的风险较高。此次检出1例胎儿TH基因复合杂合变异,胎儿产前诊断表型为NF增厚,提示胎儿患Segawa综合征风险高;在1例NT增厚的胎儿中检出MYH3复合杂合变异,相关疾病为挛缩、翼状胬肉和跖椎融合综合征1B型和远端关节挛缩。

综上所述,产前WES检测可以增加胎儿异常情况下的诊断率,还具有将已知疾病表型扩展到产前表型的潜力。而每一种形式的产前筛查或诊断方法都有其风险、益处和局限性。在产前 WES的检测中,不能对所有异常的表型进行诊断。WES不用于检测非整倍性、多倍体,也不用于检测易位、三核苷酸重复或低水平的嵌合体等;WES也不能准确检测CNV,仍需要结合CMA技术[3]。总之,在产前诊断中应用CMA和WES检测出表型多样的罕见病家系,降低了染色体病、严重遗传病等的发病率,对出生缺陷的防控具有重要意义。