傅里叶变换红外光谱技术对金银花中有效成分定量模型建立及含量测定

顾旭鹏, 杨林林*, 齐大明, 刘天亮, 董诚明*

1. 河南中医药大学药学院, 河南 郑州 450046 2. 河南省道地药材生态种植工程技术研究中心, 河南 郑州 450046

引 言

中药材金银花(LoniceraeJaponicaeFlos)来源于忍冬科忍冬属植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花, 现代研究表明, 其在清热解毒、 抗菌抗病毒、 抗氧化、 保肝、 调节免疫等方面具有良好的疗效[1]。 近些年, 特别是新冠疫情以来, 中成药莲花清瘟胶囊、 透解祛瘟颗粒(肺炎1号方)、 双黄连口服液等, 以及江西省、 河北省、 广东省、 湖北省、 天津市等发布的中医药新冠肺炎防治处方, 均含有金银花[2]。 促使了近些年金银花需求量及经济价值不断攀升, 种植面积也逐年增加, 导致了假冒伪劣问题愈发严重[3], 多见不同产地、 不同批次的金银花药材出现质量波动大、 品质优劣不一的现象。 因此寻找一种高效、 便捷的含量检测方法已迫在眉睫。

在传统模式下, 金银花有效成分含量测定主要以《中国药典》为参照, 2020年版中国药典以绿原酸、 异绿原酸A、 异绿原酸C、 木犀草苷作为金银花质量控制的主要指标, 且各个指标成分的含量测定都以HPLC法为主, 但该方法的样品前处理复杂, 样品损坏, 耗时费力, 有诸多影响因素, 更不适合大批量样品的含量测定[4]。 傅里叶红外光谱分析技术有着HPLC法所不具有的扫描速度快、 操作简便、 分析过程快速无损、 不需要样品预处理、 应用广泛等优点[5]。 因此, 以傅里叶红外光谱分析技术实现金银花有效成分的含量测定是一种更优的选择。

近些年红外光谱技术已被逐渐应用于中药质量评估、 中药真伪鉴定、 中药近缘种鉴定、 野生与栽培鉴别等[6], 鲜有使用红外光谱技术实现金银花有效成分含量测定的研究。 本研究通过使用傅里叶变换红外光谱技术, 根据金银花的红外光谱峰形、 峰位、 吸收强度等差异[7], 以及HPLC法测得的样品中绿原酸、 当药苷、 断氧化马钱子苷、 木犀草苷、 异绿原酸A、 异绿原酸C的含量, 使用TQ analyst9软件分析红外图谱, 建立金银花的定量分析模型, 以期实现金银花的快速含量测定。

1 实验部分

1.1 仪器及分析软件

Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司), BS-224S电子天平, MS105DU型半微量天平, KQ-500DV超声波清洗机(昆山市超声波清洗器)等, INVENIO—HYPERION傅里叶变换红外光谱仪(布鲁克北京科技有限公司), 万分之一分析天平AL204(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

Opus8.2.28软件, TQ analyst9软件, 中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)。

1.2 材料

绿原酸(批号: 140322), 中国食品药品检定研究院; 异绿原酸 A(wkq18041207)、 异绿原酸 C (wkq18050905)、 当药苷(wkq18042610)均购置于维克奇生物科技有限公司; 断氧化马钱子苷(批号: P27N8L49194)、 木犀草苷(批号: Y26A9H59973)均购于源叶生物科技有限公司; 色谱甲酸(北京迈瑞达), 色谱甲醇、 色谱乙腈(Fisher Scientific), 甲醇(分析纯, 天津富宇), 超纯水等。

供试样品购置2020年金银花通货, 河南30份、 河北15份、 山东19份, 经由河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定为忍冬科忍冬属植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花。

1.3 金银花六种有效成分的测定方法

1.3.1 色谱条件

参照齐大明等[8]的高效液相方法, 测定结果见表1。

表1 六种成分含量(%)

续表1

1.3.2 标准曲线的建立

参照 2020 药典金银花项下含量测定并进行线性关系考察, 线性关系见表2。

表2 六种成分线性关系

1.4 金银花定量模型的建立及成分测定

1.4.1 红外光谱采集

将购置的64份金银花样品, 经烘干处理后, 粉碎, 过四号筛。 使用傅里叶变换光谱仪对金银花样品采集红外光谱图, 采集光谱的参数为: 扫描范围8 000～0 cm-1, 谱图保存范围为4 000～400 cm-1, 分辨率为4 cm-1, 扫描速度为7.5 kHz。 以空气背景作为参照, 每次取样约31 mg于ATR仪晶体上, 每个样品20次重复, 取平均光谱进行分析。 随机取其中16份金银花样品作为验证集(HB4、 HB7、 HB10、 HB14、 HN2、 HN7、 HN9、 HN11、 HN17、 HN22、 HN23、 HN26、 SD3、 SD8、 SD13、 SD16), 其余48份样品作为标准集。 64份原始图谱见图1。

图1 64份金银花的红外原始图谱

1.4.2 定量模型的建立

有效成分含量测定及目标组分上下限设置, 上限最高为105%, 下限最低为95%, 结果见表3。

表3 目标组分上下限范围

光谱预处理: 采用偏最小二乘法(PLS)、 逐步多元线性回归(SMLR)、 多元散射校正(MSC)的方法, 然后用一阶导数(1st)、 二阶导数(2nd)及SG卷曲平滑和诺里斯导数滤波(ND)、 No Smoothing处理[9]。 以相关系数(R2)、 校正均方差(RMSEC)、 测定均方差(RMSEP)作为评价标准, 校对不同预处理方法的定量模型建立的影响,R2值越大, 说明金银花有效成分化学含量与红外测定含量的相关性越好, RMSEC、 RMSEC越小, 说明所建模型的可靠性越好[10]。 预处理结果见表4。 由表中数据分析得到绿原酸以PLS+MSC+2nd Der+NS含量测定效果最好, 当药苷以PLS+MSC+1st Der+ND对含量测定效果最好, 断氧化马钱子苷以PLS+MSC+1st Der+SG对含量测定效果最好, 木犀草苷以PLS+MSC+1st Der+NS、 PLS+MSC+1st Der+SG以及PLS+SNV+1st Der+SG含量测定效果最好, 异绿原酸A以PLS+MSC+2nd Der+ND的含量测定效果最好, 异绿原酸C以PLS+MSC+2nd Der+SG的含量测定效果最好。

表4 光谱预处理结果

光谱范围: 金银花各种成分只出现在一定的红外光谱范围, 因此图谱中每一段图谱信息都表示代表着不同的化学成分。 如果仅对样品的某个波段分析, 会有信息缺漏的可能, 因此为了能够得到更准确的相关波谱, 光谱参数的选择根据软件推选出的光谱范围, 滤过噪音影响较大的光谱波段, 最终所选取的波段是3 855～745 cm-1。

模型建立: 运用偏最小二乘法(PLS)、 逐步多元线性回归(SMLR)、 多元散射校正(MSC)的方法, 用一阶导数(1st)、 二阶导数(2nd)及SG卷曲平滑、 No Smoothing处理建立金银花的定量分析模型。 绿原酸的建模方法为PLS+MSC+2nd Der+NS, 相关系数为0.754 9, RMSEC值为0.356 0, RMSEP值为0.497 0; 当药苷的建模方法为PLS+MSC+1st Der+ND, 相关系数为0.936 9, RMSEC值为0.017 6, RMSEP值为0.038 0; 断氧化马钱子苷的建模方法为PLS+MSC+1st Der+SG, 相关系数为0.967 8, RMSEC值为0.043 9, RMSEP值为0.265 0; 木犀草苷的建模方法为PLS+MSC+1st Der+NS、 PLS+MSC+1st Der+SG以及PLS+SNV+1st Der+SG, 相关系数为0.859 0, RMSEC值为0.007 6, RMSEP值为0.010 0; 异绿原酸A的建模方法为PLS+MSC+2nd Der+ND, 相关系数为0.933 9, RMSEC值为0.126 0, RMSEP值为0.390 0; 异绿原酸C的建模方法为PLS+MSC+2nd Der+SG和PLS+SNV+2nd Der+SG, 相关系数为0.866 1, RMSEC值为0.034 2, RMSEP值为0.075 4。 绿原酸、 当药苷、 断氧化马钱子苷、 木犀草苷、 异绿原酸A、 异绿原酸C含量测定值与参考值的线性关系如图2(a—f)。

图2 测定值与参考值的线性参考图

1.4.3 定量模型的验证

将随机抽取的验证集10份样品用于验证所建定量模型的准确性。 将红外光谱输入所建立的模型中, 测定金银花样品中有效成分的含量。 以绝对偏差作为性能指标。 测定结果见表5。 建立的金银花定量模型对绿原酸的平均绝对偏差为0.24%, 对当药苷的平均绝对偏差为0.00%, 对断氧化马钱子苷的平均绝对偏差为-0.06%, 对木犀草苷的平均绝对偏差为0.01%, 对异绿原酸A的平均绝对偏差为0.11%, 对异绿原酸C的平均绝对偏差为0.01%。 表明建立的绿原酸、 当药苷、 断氧化马钱子苷、 木犀草苷、 异绿原酸A、 异绿原酸C的方法具有良好得测定能力。

表5 验证集样品测定结果

2 结 论

红外光谱定量原理是依据标准或参考样品的光谱信息, 运用化学计量学建立定量模型并进行验证, 然后用所建模型测定样品组分的含量[11]。 傅里叶变化红外光谱能够提供中药复杂混合物的整体特征信息, 利用红外光谱技术对生中药进行内在质量评价目前更多的处于方法学探讨之中[12-13]。 本研究将HPLC法与傅里叶变换红外光谱技术相结合, 建立的金银花六种有效成分的定量模型能够实现对金银花中的绿原酸、 当药苷、 断氧化马钱子苷、 木犀草苷、 异绿原酸A、 异绿原酸C的含量进行快速、 无损、 简便的测定, 所建立的定量模型除了绿原酸外相关系数都达到0.85以上, 建立的定量模型较为客观。

《中国药典》对中药材的质量评价通常以有效成分的含量作为评价指标, 而传统的检测方法HPLC、 UV-Vis等避免不了复杂的样品前处理、 难度较高的仪器操作以及中药材的损耗等问题, 现代红外光谱技术能够很好地改善这些缺点, 具有扫描速度快、 操作简便、 分析过程快速无损、 不需要样品预处理、 应用广泛等优点, 更重要的是可以实现大批量样品的准确测定, 这是传统方法所不能实现的, 近几年, 基于傅里叶变换红外光谱技术陆续实现了地黄[4, 13]、 白芷[7]、 防风[14]、 当归[15]、 肉桂[16]、 白芍[17]中有效成分的含量测定, 也预示着红外光谱技术在中药质量控制中的应用趋势日益增加。

红外光谱作为一种新兴技术, 在定性定量分析中, 会受到样品粉末大小、 均匀性、 温度、 湿度、 光谱信号的识别等诸多因素的影响[11], 导致所采集的红外谱图出现误差, 影响后期建模的效果, 因此运用红外光谱技术建立定量模型要多次重复采集红外谱图以尽可能较小偶然误差带来的影响。 就目前研究水平, 制约了红外光谱技术在中药质量控制的全面推广应用, 因此完善中药材的光谱模型系统并提高模型的稳定性和准确率, 是未来需要突破的重点。

将红外光谱技术与高效液相色谱技术相结合可以实现中药材含量的快速含量测定。 本研究所建立的金银花定量模型稳定、 可靠, 能够实现金银花中有效成分的含量测定。 可以通过现代红外光谱技术实现中药材的快速、 无损检测, 从而降低中药材含量检测成本, 提高中药材含量检测效率, 为保障中药材质量和安全提供参考依据。