丙酮盐酸混合液提取土壤腐殖质组分的光谱学特征

宋 鸽, 孔祥仕

1. 黑龙江大学中俄学院, 黑龙江 哈尔滨 150080 2. Institute of Earth Sciences, St. Petersburg State University, St. Petersburg 199034, Russia 3. 吉首大学旅游学院, 湖南 吉首 416000

引 言

腐殖质(humic substances, HS)是动植物残余物经化学、 生物转化, 以及微生物代谢等形成的天然高分子化合物, 是地球表面主要有机碳库[1]。 在腐殖化过程中, 原本结构明确的四大类生物分子单体(蛋白质、 多糖、 脂质和木质素)经缩合, 转化为功能相似但结构各异的HS, 形成的HS并不是前体生物分子单体间的简单加和, 而是形成了具有独特结构属性的一系列高分子化合物或混合物[2]。 HS呈棕褐色、 无定形、 具有亲水性、 多分散性和酸性, 因此IHSS建议采用混合碱液(NaOH+Na4P2O7)提取法获取HS, 事实上此种方法提取费时、 提取率低。 土壤HS包括胡敏酸(HA)、 富里酸(FA)和胡敏素(HU)。 HA和FA统称为腐殖酸, 是HS中的活性部分[3], 其化学组成中羧基和羟基等含氧官能团的存在能够促进植物生长发育。 HU与无机矿物紧密结合, 在任何pH水溶液中都不溶解, 在维持土壤结构、 保持土壤养分和调节土壤营养元素循环等方面具有重要作用。

不同的提取方法获取HS组分在化学组成和分子结构上存在差异。 近年来, 众多学者通常采用IHSS(国际腐殖质协会)推荐的混合碱液提取法, 比较不同来源HS化学组成和分子结构差异, 研究HS化学组成和分子结构某些“重要结构原件”与其生理活性的相关性。 由于传统的碱液提取法对土壤HS提取不够充分, 碱液能够水解土壤有机质并破坏其化学结构, 现今的研究技术和手段无法明确HS化学结构等, 因此已有的研究成果仅停留在理论假设阶段。 目前土壤HS研究更多的关注不同外界因素影响下HS组分含量的变化, 对于在不同土地利用方式下HS化学组成和结构特征变化规律的研究较少。 本文首次采用丙酮盐酸混合液, 从开垦和未开垦土壤样品中提取HA和HU, 利用元素分析、 紫外-可见漫反射光谱和近红外光谱等手段研究HS化学组成和分子结构特征, 比较开垦和未开垦不同类型土壤HA和HU化学组成和结构特征的变化, 力争为HS生物化学和生理活性的研究提供新的技术手段, 为合理利用土壤资源提供理论依据。

1 实验部分

1.1 土壤样品

土壤样品采自俄罗斯西南部贝尔戈罗德地区, 该地区的特点是温带大陆性气候, 夏季炎热干燥, 冬季寒冷。 年平均气温+6 ℃, 1月平均气温-8.1 ℃, 7月平均气温+19.9 ℃。 本研究所选土壤样品分别为未开垦黑土(10～20 cm, AU1; 20～40 cm, AU2)、 开垦黑土(10～20 cm, PU1; 20～40 cm, PU2)、 未开垦灰土(0～18 cm, AY; 18～37 cm, AEL)、 开垦灰土(0～15 cm, PY1; 15～30 cm, PY2)。 各样地采用五点取样法收集土样, 风干去除草根、 砂粒等, 研磨过2 mm筛备用。

1.2 HS组分提取及纯化

称取100 g过筛风干土样, 溶于1 L丙酮盐酸(90%丙酮∶HCl=9∶1,m∶m)混合溶液, 静置过夜, 3 000～4 000 r离心30 min, 过滤收集滤液, 滤液用去离子水稀释2倍, 静置过夜后, 3 000～4 000 r离心 30 min, 收集沉淀, 保留上清液。 沉淀用0.02 mol·L-1NaOH溶液溶解, 过阳离子交换树脂进行纯化, 洗脱液冷冻干燥得到HA干物质。 将保留上清液用0.1 mol·L-1NaOH溶液滴定至pH 7, 获得HU沉淀, 弃掉上清液, 沉淀多次用去离子水洗涤, 直至AgNO3溶液滴定上清液检测不到Cl-, 将沉淀冷冻干燥, 获取HU干物质备用。

1.3 元素分析

分别称取冷冻干燥HA和HU样品约2 mg于德国Elementar公司生产的Vario Microcube元素分析仪上测定C、 H、 N和S元素含量, 其中O元素含量采用差减法计算。

1.4 紫外-可见漫反射光谱

采用紫外-可见漫反射光谱仅对HA和HU固体粉末进行扫描, 波长范围200～800 nm。 在254 nm处测定吸光度, 记为SUVA254。 在465和665 nm处分别测定吸光度, 记为E4和E6, 并计算E4/E6值[4]。

1.5 近红外光谱分析

分别称取2 mg冷冻干燥HA和HU样品与100 mg KBr混合, 充分研磨后压片并放入红外干燥箱中干燥以除去样品中水分子的影响。 采用Vertex 70型傅里叶变换红外光谱仪(Bruker, 德国)进行红外光谱分析, 测定参数为: 分辨率4 cm-1; 测定范围: 4 000～400 cm-1。 对谱线选取特征峰, 并对相应的官能团进行半定量分析。

1.6 数据统计分析

紫外-可见漫反射光谱和近红外光谱数据采用OriginPro8.0软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 HS元素分析

表1 HA各种元素含量和原子比

表2 HU各种元素含量和原子比

比较开垦和未开垦土壤的不同土层中提取HA的元素组成, AY的C和H元素含量最高, O元素含量最低, 原子比H/C比值最大, O/C比值最小, 说明缩合度最小, 分子结构最简单, 氧化度最小, 羧酸等含氧官能团含量最少, 而C/N比值最大, 腐殖化程度最低, 稳定性最小, 而(N+O)/C比值最小, 极性最小。 PU2的C和N元素含量最低, O元素含量最高, O/C和(N+O)/C比值最大, 说明羧酸等含氧官能团含量、 氧化度和极性最大(表1)。 对于开垦和未开垦土壤的不同土层中提取HU的元素组成, AY的C、 H、 N和S元素含量最高, O元素含量最低, 原子比H/C比值最小, 说明缩合度最大, 结构较为复杂, 而PY1的C、 H和S元素含量最低, O元素含量最高, O/C和(N+O)/C比值最大, 说明氧化度、 羧酸等含氧官能团含量和极性最大(表2)。 比较开垦因素对黑土和灰土HA和HU各种元素含量和原子比的影响, 可知开垦因素对黑土HA和HU元素组成和原子比影响相对较小, 而开垦因素明显增加了灰土HA和HU中O元素和含氧官能团的含量、 氧化度和极性, 原因可能是黑土成土条件和过程相对复杂, 外界扰动因素对其影响相对较小, 而开垦因素促进灰土土壤有机质的分解, 复杂的有机大分子结构氧化分解转变为相对简单的小分子结构。

2.2 HS紫外-可见漫反射光谱

开垦和未开垦土壤的不同土层中HA和HU紫外-可见漫反射光谱形状相似, 吸光度值随着波长的增加呈下降趋势。 由于HS的组成复杂, 多种官能团互相干扰, HA和HU紫外-可见漫反射光谱无明显特征峰, 吸光度值大表明其包含的吸光基团较多。 PY2的HA吸光度值最大, AU1吸光度值最小, 表明PY2包含的吸光有机成分最多, AU1包含的吸光有机成分最少(图1)。 AY的HU吸光度值最大, 其余研究对象的吸光度相对较小, 说明AY包含的吸光有机成分最多(图2)。 各研究对象HA吸光度值大于HU吸光度值, 说明HA包含的吸光有机成分较多, 化学组成较为复杂。

图2 HU紫外-可见漫反射光谱

紫外特征参数SUVA254常被用来表征HS的芳香性[8]。 比较HA和HU的SUVA254可知(表3和表4), HA芳香性大于HU, 即HA包含更多的芳香结构, 与元素分析中原子比C/H分析结果完全相符。 此外,E4/E6与HS的芳香度和芳香碳链的缩合程度有关, 可以作为腐殖化程度的指标[9]。E4/E6值越大, 芳香族组分的缩合度越小, 分子结构越简单, 分子量越小[10], 腐殖化程度越低。 事实上E4/E6值与分子量相关性的研究还存在争议[11]。 比较HA和HU的E4/E6可知(表3和表4), HU芳香族组分的缩合度较小, 分子结构较为简单且腐殖化程度低, 这与元素分析的结果基本一致。 将开垦和未开垦土壤某一土层中HA和HU紫外特征参数与元素分析原子比计算结果进行对比分析, 二者结论不完全相符, 由于HS超分子结构和官能团组成的复杂性, 对于相同来源同一HS组分结构的全面表征还需要多种技术手段联用。

表3 HA紫外特征参数

表4 HU紫外特征参数

2.3 HS红外光谱

图3 HA红外光谱

图4 HU红外光谱

表5 HA红外光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量)

表6 HU红外光谱主要吸收峰的相对强度/cm-1(半定量)

3 结 论

HA是土壤有机质中的活性组分, 而HU是土壤有机质中的惰性组分, 与矿物质紧密结合具有碱不溶性和大分子结构的特性, 呈现不均一性。 本研究采用丙酮和盐酸混合液从土壤样品中分离提取HA和HU组分, 为HS生物化学和生理活性的研究提供了新的技术手段。 采用元素分析和光谱学等对HA和HU进行元素分析和光谱学特征研究, 结果表明, HA和HU具有相似的元素和官能团组成, HA和HU的元素组成以C和O元素为主, 原子比分析表明, HA的结构以芳香族结构为主, 而HU的结构以脂肪族结构为主。 HA和HU紫外-可见漫反射光谱形状相似, 无明显特征吸收峰, 吸光度随着波长的增加呈下降趋势。 与HU相比, HA包含的吸光有机成分较多, 化学组成较为复杂。 此外, HA和HU的紫外特征参数SUV254和E4/E6与元素分析中原子比分析结果基本相符, 而对于相同HS组分某一土层中HA和HU的分析不完全相符, 需要多种光谱学手段联用全面表征HS结构特征。 HA和HU具有相似的红外光谱图, 各主要特征吸收峰的吸收强度不同。 开垦黑土20～40 cm(PU2)和未开垦灰土18～37 cm(AEL)的HA在各特征吸收峰的振动幅度均最大, 表明两者所包含的酚类化合物、 含羟基化合物、 脂肪族化合物、 羧酸、 以及含羰基的醛、 酮和醚等化合物含量最多, 而未开垦灰土18～37 cm(AEL)和开垦黑土10～20 mm(PU1)的HU在各特征吸收峰振动幅度最大, 说明其包含的酚类化合物、 羧酸、 脂肪族和糖类化合物含量较多。

不同的土地利用方式下, 由于管理措施、 凋落物量和质量差异的影响, 可能导致土壤HS结构和性质等方面发生改变。 由红外光谱分析可知, 开垦对黑土和灰土的影响不同, 开垦后黑土HA和HU酚类化合物、 羟基官能团和脂肪族化合物等含量增加, 而开垦后灰土HA和HU酚类化合物、 羧基和脂肪族化合物含量下降, 原因可能是黑土成土条件和过程相对复杂, 外界扰动因素对土壤有机质影响相对较小, 外界开垦因素在一定程度上增加了土壤有机质含量, 而开垦因素促进灰土土壤有机质的分解, 这与元素分析的结果基本相符。

丙酮盐酸混合液提取法为HS生物化学和生理活性的研究提供了新的技术手段, 为合理利用土壤资源提供理论依据。