红芪抗放化疗所致靶器官损伤作用机制及其“构-效-量”关系

赵沙沙,何 海,王姿杨,邢耀莹,任 远,邵 晶,3,4

(1.甘肃中医药大学,2. 西北中藏药省部共建协同创新中心,3.甘肃省中药药理与毒理学重点实验室,4.甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室 ,甘肃 兰州 730000)

放化疗作为肿瘤治疗的主要方式之一,会引起肝、肾、胃肠等方面的靶器官损伤,其副作用不可忽视。放疗过程中,射线在穿透人体组织到达肿瘤前,会对正常组织造成一定损伤;化疗是一种全身性的治疗手段,在杀伤和抑制癌细胞的同时,又不可避免地对正常组织和器官产生毒性,例如骨髓抑制、胃肠道毒性、肝脏毒性、肾和膀胱毒性、免疫功能低下等[1]。红芪是甘肃的道地药材,为HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根。2020版《中华人民共和国药典》记载其具有补脾益气、生津养血、固表止汗及利水消肿等功效,现代研究表明,其具有抗炎[2]、抗肿瘤、防治肝损伤、胃损伤等[3]药理作用。此外,文献报道红芪提取物对放射性心肌细胞损伤、放射性肺损伤[4]具有保护作用,但其抗放化疗所致的靶器官损伤保护作用的可能药效机制并未明确。

中医的医疗理念具有整体观、系统观的特点,中药作用机制具有“多组分、多靶点、多通路”的特点[5]。网络药理学-分子对接技术的应用突破了传统研究方式,是现代生物医药研究的哲学理念与研究模式的转变的代表性研究理念和方法。其可多层次、多角度分析中药治疗疾病的物质基础及作用机制的特点,与中医药的特点殊途同归。因此,本研究通过网络药理学和分子对接技术预测红芪抗放化疗所致靶器官损伤保护作用的潜在“成分-靶点-通路”,基于其潜在作用机制通过动物实验验证,并结合HPLC含量测定探讨其主要活性成分的“量-效”关系,为后续研究及临床应用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 动物SPF级Wistar种大鼠,雌雄各半(200±20 g),购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心,许可证号:SCXK(甘)2020-0002,质量合格证号:0002370,适应性饲养1周,饲养于甘肃中医药大学SPF实验动物中心。

1.2 药品及试剂红芪药材购自甘肃普兰特有限公司,经甘肃中医药大学崔治家教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz的干燥根。对照品:毛蕊异黄酮(批号:Y29J2H391 62)、金雀异黄酮(批号:H30A9Z69019)、毛蕊异黄酮苷(批号:Y16O11H127829)、芒柄花黄素(批号:H06S9Z69494)、槲皮素(批号:C28J11Y116820)、刺芒柄花苷(批号:M02A11S120167)、异甘草素(批号:H03D9Z76567)、美迪紫檀素(批号:Y12M11H112983)纯度均≥98%,购自上海源叶生物科技有限公司,贞芪扶正颗粒(批号:K20210842)购自甘肃扶正药业科技股份有限公司,注射用顺铂(冻干型)(批号:1J0535B03)购自齐鲁制药有限公司。肌酐含量试剂盒(Cr,批号:20220601-RXWB0459-96)、尿素试剂盒(BUN,批号:20220601-RXWB0153-96)、丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT,批号:20220601-RXWB0374-96)、天冬氨酸氨基转移酶(AST,批号:20220601-RXWB0098-96)试剂盒、大鼠胃动素ELISA试剂盒(MTL,批号:20220601-RX302272R)、大鼠血管活性肠肽ELISA试剂盒(VIP,批号:20220601-RX302215R)、大鼠白细胞介素10 ELISA试剂盒(IL-10,批号:20220601-RX302880R)、大鼠肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(TNF-α,批号:20220601-RX302058R),均购自泉州市睿信生物科技有限公司。乙腈、甲酸、甲醇(色谱纯,天津大茂化学制剂厂),95%乙醇,乙酸乙酯,石油醚,正丁醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂),水为超纯水。

1.3 仪器Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司),XS205DU型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司),CP513型电子分析天平(奥豪斯仪器常州有限公司),DHG-9070B型智能电热恒温鼓风干燥箱(上海琅玕实验设备有限公司),Milli-Q超纯水系统(德国墨克生命科学公司),SHB-IIIA型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),SB-5200DTD型超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司),HH-s4型恒温数显水浴锅(江苏正基仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 网络药理学及分子对接的作用机制与“构-效”预测

2.1.1红芪活性成分的筛选 以TCMSP线上数据库筛选红芪化学成分。以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为筛选条件。筛选得到美迪紫檀素、毛蕊异黄酮、芒柄花素等14个成分,由于所得成分中具有代表性的成分不多,因此查阅文献筛选近年学者研究较多的成分,另加入红芪所含的金雀异黄酮、毛蕊异黄酮苷等13种成分,共27种成分(如Tab 1所示),使得基础分析对象的数据能尽可能全面并接近原中药功效的整体性和真实性。

2.1.2红芪对放化疗引起的靶器官损伤保护作用靶点的获取 基于“2.1.1”得到的化合物利用Uniprot线上数据库和SwissTarget Prediction在线平台预测红芪活性成分靶点324个;在人类基因数据库(Gene Cards)和比较毒物基因组学数据库(CTD)两个平台,以“Target organ damage caused by radiotherapy and chemotherapy”为检索词,获得放化疗引起的靶器官损伤的疾病靶点2 069个,对活性成分和疾病预测靶点进行映射取其交集,筛选得到红芪对放化疗引起的靶器官损伤保护作用的潜在靶点177个。

Tab 1 Main active components of Radix Hedysari screened out

2.1.3“中药-化合物-靶点”网络的构建 将“2.1.1”所得27种成分及“2.1.2”所得177个交集靶点导入Cytoscape 3.8.2软件构建可视化调控网络,以探究红芪抗放化疗引起的靶器官损伤的药效作用机制。如Fig 1所示,红色代表化合物,紫色代表靶点,分为3圈,由里到外分别代表可被1种化合物调控(103)、可被2-3种调控(44)、可被4种以上调控(26)。按照degree值≥20的化合物有4种,分别为槲皮素(105)、熊果酸(44)、芒柄花素(24)、柚皮素(22),分别可调控145、43、23、21个靶点,可作为重点化合物。

2.1.4PPI蛋白互作网络构建及关键靶点筛选 将“2.1.2”所得177个交集靶点导入String数据库对其潜在靶点进行蛋白互作,选择最高置信度0.900,得到初级互作网络并以Cytoscape 3.8.2软件进行拓扑分析。以Degree进行分析,以网络参数中心性、接近中心度、中介中心度3种条件进行限定和筛选,得到起调控作用的8个关键靶点(TP53、MAPK1、MAPK3、AKT1、JUN、HSP90AA1、TNF、ESR1)。PPI网络图如Fig 2所示,黑色框中绿色圆形节点为红芪-放化疗引起的靶器官损伤预测靶点,三角符号为Degree>15所得节点,蓝色框中棱形节点为betweeness>0.042所得节点,绿色框中V形节点为closeness>0.340所得关键节点,靶点信息见Tab 2。

Tab 2 PPI core target information

2.1.5 生物信息学分析将“2.1.2”筛选所得177个共同靶点导入Omicshare平台进行KEGG和GO分析。

2.1.5.1 基因本体(GO)分析 GO分析得到(Pvalue<0.01)184个细胞组分(CC),红芪抗放化疗引起的靶器官损伤靶点基因在细胞组分(CC)层面与膜区域、膜微区、膜筏、细胞质部分有最显著相关;而在312个分子生物学功能(MF)层面最显著表现的是信号受体结合活性和酶结合活性,其次为转录因子结合活性;参与了3 182个生物过程(BP)富集到最主要的途径为对化学物质的反应、对有机物的反应、对含氧化合物响应,见Tab 3。

2.1.5.2 京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析 KEGG分析得到(Pvalue<0.01)150条通路,Fig 3展示了前20个显著差异通路,一级分类有4种:环境信息加工分类、细胞过程、生物体系统、人类疾病分类。前3种分类各自仅一条通路排入前20,可作为重点通路:肿瘤坏死因子信号通路(ko04668)、细胞衰老(ko04218)、白细胞介素-17信号通路(ko04657),第4种则有17条富集通路,其中膀胱癌(ko05219)Rich Factor值最大,Pvalue值最小,可作为此类重要的通路。四类一级分类相较而言,人类疾病分类在红芪抗放化疗引起的靶器官损伤的通路中更重要些,其次为生物体系统分类和环境信息加工分类。

Fig 1 Diagram of “herbs, components and targets”

Fig 2 PPI network diagram

2.1.6“活性成分-靶点”的分子对接验证 以“2.1.4”所得8种核心靶点基因作为受体;以“2.1.3”所得4种重点活性成分作为配体。利用Uniprot数据库获得靶点唯一且稳定的条目识别符(Entry号),输入蛋白质结构数据库(RCSB PDB),以pdb格式导出选择分辨率(refinement resolution Å)分辨率最好的且自带小分子配体的结晶复合物;由TCMSP数据库和ChemBio3D Ultra 14.0软件得到活性成分3D分子结构,分别进行分子对接获得亲和力分析,以结合能≤-5.0 kJ·mol-1作为筛选标准,对其进行最低能量的计算和结构的优化,获得稳定的分子构象。并利用Pymol和AutoDockTools-1.5.6处理配体和受体,以Vina进行运算对接,对比其亲和力大小和构象的合理性,获得最佳受体蛋白和配体分子,利用Pymol和Ligplot软件进行可视化。

对接结果显示,与槲皮素具有高亲和力的为HSP90AA1(6tn5蛋白受体),与熊果酸具有高亲和力的为TP53(3d06蛋白受体),与芒柄花素具有高亲和力的为HSP90AA1(6tn5蛋白受体),与柚皮素具有高亲和力的为MAPK3(9qtb蛋白受体),见Tab 4。

Fig 4各化合物分子对接分析结果显示,分子均位于蛋白的活性空腔内,且两者均有较好的匹配,为红芪中这4种化合物与蛋白受体间的相互作用提供了基础。相互作用2D图中4种成分分别与周围的蛋白质残基形成的氢键作用力(绿色虚线)和疏水作用力(红色半弧形),各化合物与周围氨基酸残基结合紧密,存在着明显的作用力,这些结构与特点的存在,增强了化合物与靶点蛋白之间的相互作用,使化合物和对应靶点对接形成稳定构象,有助于与靶点蛋白的结合。

2.2 “构-效-量”关系验证

2.2.1动物实验验证

2.2.1.1分组造模及给药 分组:以苦味酸对大鼠进行顺序编号,随机分为7组,每组6只。包括正常组(normal group,NG)、模型组(model Group,MG)、对照组(control group,CG)、药物组:(水提物低剂量组(water extract group-L,WEG-L)、水提物中剂量组(water extract group-M,WEG-M)、水提物高剂量组(water extract group-H,WEG-H)。

Tab 4 Molecular docking affinity table of main active components of Hedysari Radix and key targets

Fig 4 Results of molecular docking analysis

造模给药:除正常组外均以1 mg·kg-1顺铂腹腔注射,连续7 d,进行造模,正常组:每只灌胃0.9%氯化钠溶液1 mL/100 g灌胃,连续7 d;对照组:贞芪扶正颗粒0.54 g·kg-1连续7 d灌胃给药;药物组:按照大鼠体质量连续7 d灌胃给药(水提物低剂量组1.35 g·kg-1,水提物中剂量组2.7 g·kg-1,水提物高剂量组5.4 g·kg-1,均按生药量计算)。

(注:给药按体表面积折算,人的临床剂量与大鼠的等效剂量的比值为0.018。成人体质量70 kg,大鼠体质量0.2 kg)

大鼠剂量=30 g/70 kg×70 kg×0.018/0.2 kg=2.7 g·kg-1

2.2.1.2 体质量及进食量监测 从d 1起,每日定量给食100 g,并于每日相同时间对各鼠进行称体质量,以便从外部观测其体质量及进食量变化。Fig 5显示,除正常组外进食量均逐渐降低,模型组比较其他组进食量最低。体质量均呈现先升高后降低的情况,模型组的体质量自d 2起降低幅度最大。

Fig 5 Weight and water intake of rats with Hedysarum rubrum

如Fig 6所示,各因子模型组含量均明显增加或降低(P<0.01),对照组与模型组相比各因子含量差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05),Fig 6A显示与模型组相比VIP和MTL含量均明显升高(P<0.01),肝因子AST和ALT以及肾因子Cr和BUN均出现明显的降低(P<0.01或P<0.05)如Fig 6B,C,如Fig 6D所示,抑炎因子IL-10回升,促炎TNF-α下降(P<0.05)。

2.2.2主要成分的含量测定

Fig 6 Effect of Radix Hedysari on contents of various factors in serum of rats with target organ injury caused by

2.2.2.1 色谱条件 色谱柱:大连依利特SinoChrom ODS-AP(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:25℃;流动相:乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B);梯度洗脱(0～15 min,17%～33% A;15～20 min,33%～34% A;20～24 min,34%～37% A;24～27 min,37%～38% A;27～30 min,38%～40% A;30～35 min,40%～43% A;35～45 min,43%～90% A);流速为0.6 mL·min-1;检测波长:260 nm;进样量为10 μL。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 称取红芪饮片100 g,加10倍量水,回流两次,分别2.0 h和1.5 h,合并两次滤液并浓缩、干燥至恒重。精密称取上述水提物0.250 0 g,置于5 mL容量瓶中,加甲醇溶解,定容,即得。

2.2.2.3 对照品溶液的制备 称取各对照品适量,加甲醇分别制成一定浓度的母液,后分别量取一定体积混合,配制成每1 mL含0.024 0 mg毛蕊异黄酮苷、0.028 8 mg刺芒柄花苷、0.024 0 mg毛蕊异黄酮、0.024 0 mg槲皮素、0.025 2 mg金雀异黄酮、0.024 0 mg异甘草素、0.026 4 mg芒柄花素、0.027 6 mg美迪紫檀素的混合对照品溶液,即得。

2.2.2.4 方法学考察

2.2.2.4.1 线性关系考察 取混合对照品溶液,用甲醇稀释成系列不同浓度,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,以浓度(g·L-1)为横坐标,峰面积为纵坐标,考察各成分的线性关系,结果表明各成分线性关系良好,具体见Tab 5。

2.2.2.4.2 精密度 精密吸取同一对照品溶液,连续进样6次,记录各成分峰面积,分别计算RSD值,结果显示6次检测结果各成分相对峰面积的RSD均小于1.0%,表明仪器精密度良好。

2.2.2.4.3 重复性 精密吸取红芪供试品溶液,平行制备6份样品,进样测定,记录各成分的峰面积,分别计算RSD值,结果显示6份样品中各成分相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明各成分在此方法下的重复性良好。

Fig 7 Chromatogram

Tab 5 Results of linear relationship test of eight active components in Radix Hedysari

2.2.2.4.4 稳定性 精密吸取红芪供试品溶液,分别在0、2、4、8、12、24 h进样,记录各成分的峰面积,结果显示各成分6个时间点检测的相对峰面积的RSD均小于3.0%,表明各成分在24 h内均稳定性良好。

2.2.2.4.5 加样回收率试验 取已知成分含量的红芪供试品9份,每份约25 mg,按低、中、高3组分别精密加入各对照品溶液,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件进样测定,计算加样回收率及RSD,结果显示毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、槲皮素、金雀异黄酮、异甘草素、芒柄花素、美迪紫檀素的平均回收率依次为97.80%、101.15%、100.19%、100.69%、103.01%、102.58%、97.51%、99.05%,RSD值依次为0.43%、0.29%、0.42%、0.37%、0.27%、0.88%、0.40%、0.56%。

2.2.2.5 样品含量测定 称取红芪水提物,并按照“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按照“2.2.2.1”项下色谱方法进行测定,分别计算红芪中8个活性成分的含量。

结果显示,芒柄花苷含量最高,达到2.743 5 μg·g-1,毛蕊异黄酮苷含量第二(2.449 0 μg·g-1),而二者的苷元含量分别为芒柄花素(1.038 6 μg·g-1)、毛蕊异黄酮(1.270 3 μg·g-1),其他成分含量为美迪紫檀素(1.587 2 μg·g-1)、异甘草素(1.103 2 μg·g-1)、金雀异黄酮(0.715 9 μg·g-1)、槲皮素(0.618 5 μg·g-1)。

Fig 8 Content of different components of Radix Hedysari

3 讨论

本文通过网络药理学筛选出4种抗放化疗所致靶器官损伤的有效活性成分和相应的8个靶点及4条重要信号通路。在此基础上将筛选出的4种化学成分与8个靶点进行分子对接,结果表明槲皮素与HSP90AA1,熊果酸与TP53,芒柄花素与HSP90AA1,柚皮素与MAPK3具有较好的结合活性,这提示HSP90AA1、TP53、MAPK3可能为红芪抗放化疗所致靶器官损伤的重要靶点。HSP90AA1为14号染色体的基因,该基因编码的蛋白质是可诱导的分子伴侣,能维持和调节特定靶蛋白的结构和功能的完整性从而调节细胞存活、增殖与凋亡。冯茵怡等[6]研究表明,通过调控HSP90AA1靶点介导信号通路可发挥抗纤维化作用。TP53为17号染色体的基因,由这种基因编码的蛋白质是一种转录因子,其控制着细胞周期的启动,DNA损伤时,TP53被激活,从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老、DNA修复或代谢改变。齐振强等[7]研究表明,上调TP53蛋白表达可对肾小球内皮细胞缺血损伤具有显著保护作用。MAPK3为丝裂原活化蛋白激酶3,参与细胞因子的产生、胞吞作用、细胞迁移、染色质重塑和转录调节。已有研究发现MAPK3表达的下调在炎性肠病相关的结直肠癌中发挥着重要的作用。

本研究对靶点进行富集分析,以探寻红芪抗放化疗所致靶器官损伤所调控的重要信号通路及其作用机制,结果显示膀胱癌信号通路、TNF信号通路、细胞衰老、IL-17信号通路等与其保护作用密切相关。四条重点通路中,膀胱癌通路中肿瘤通常以p53和RB通路的改变为特征,这些通路通常通过与Ras-丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(MAPK)相互作用来调节细胞周期[8]。IL-17信号通路由IL-17A-F组成的细胞因子通路集合,IL-17家族是细胞因子的一个新分类亚群,在急性和慢性炎性反应中均起关键作用[9]。TNF信号通路中主要的靶点为TNFR1和TNFR2,研究发现TNF通过这两种跨膜受体发挥生物效应。TNFR1在几乎所有类型的细胞上都表达[10],是主要负责启动炎症反应的TNF受体。

分子对接显示4种化合物与蛋白受体之间均有较好的匹配,相互作用分析表明两者可形成较稳定的氢键和产生较有利的疏水作用。研究发现槲皮素可改善胃溃疡并可调控肝自噬[11],可通过抑制MAPK途径改善缺血/再灌注损伤的伤口愈合过程[12];芒柄花素为红芪的主要活性成分之一,对顺铂所致以及脓毒症诱导的急性肾损伤具有一定保护作用[13],可减少小肠黏膜损伤[14];另有研究表明,柚皮素可以降低血管炎性、抑制肝纤维化[15]、改善肾损伤;熊果酸被发现可通过抑制NOX4/ROS和RhoA/ROCK1信号通路逆转肝纤维化[16]并可通过通过诱导自噬治疗急性肾损伤发挥抗炎活性[17]。

动物实验表明,红芪水提取物可提升顺铂所致的胃肠损伤因子VIP和MLT的表达水平,可降低肾损伤因子Cr和BUN以及肝损伤因子AST和ALT的表达水平,提示红芪对顺铂所致的靶器官损伤具有一定的保护作用且存在剂量依赖,其中高剂量组各因子改善效果更明显。此外抑炎因子IL-10和促炎因子TNF-α的表达水平有所改善,表明红芪水提物对于顺铂所致的机体炎性损伤有所修复。

本实验建立了8种黄酮类成分同时测定的含量测定方法,结果表明芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、美迪紫檀素含量较高。但是网络药理学和分子对接结果显示芒柄花素在调控红芪抗放化疗所致靶器官损伤的过程中起重要作用。其原因可能是黄酮苷类化合物进入人体会被肠道微生物所产生的酶分解为相对应的苷元而发挥作用[18],故推测红芪抗放化疗所致靶器官损伤的真正效用计量应以芒柄花苷和芒柄花素合计,这与生物体内苷和苷元的相互转化有关。

本研究建立了红芪成分的“构”与其对放化疗所致靶器官保护的“效”之间的关系,初步探讨阐明了红芪通过多成分、多靶点、多通路对放化疗引起的靶器官损伤保护作用的可能性分子机制:芒柄花素、槲皮素、熊果酸、柚皮素等活性成分作用于TP53、HSP90AA1、MAPK3等靶点调节膀胱癌、TNF信号通路、细胞衰老、IL-17信号通路等多条通路发挥作用,同时通过动物实验进一步对“效”进行协同验证,并利用HPLC法对其活性成分的“量”进行测定,构建了红芪对靶器官保护的“构-效-量”关系,以期为红芪抗放化疗所致靶器官损伤的物质基础及作用机制研究提供理论依据。