基于IL-6/STAT3 和IL-2/STAT5 信号通路探讨伏九贴敷药物调控Th17/Treg 免疫平衡的抗哮喘作用机制

付昆，杨艳，陆一菱，仲蓬，赵岚，徐敏（成都市第三人民医院，西南交通大学附属医院，重庆医科大学附属成都第二临床学院，四川 成都 610031）

哮喘是全世界最流行的慢性呼吸道疾病，其患病率是慢性阻塞性肺病的两倍[1]。近年来，哮喘的发病率呈上升趋势，已经成为危害人类生命健康的世界性公共卫生问题之一。祖国医学采用中医药防治哮喘积累了丰富的经验，通过多种途径的治疗方法，取得了良好的治疗效果。穴位贴敷法是其中一种中医外治的方法。清代医家张璐的“白芥子涂方”被后世医家视为穴位贴敷治疗支气管哮喘和支气管炎的经典方法而一直沿用至今，我院开展的伏九贴敷也是在此基础上加减而来，由白芥子、甘遂、延胡索、细辛组成。该法通过药物和腧穴共同作用防治哮喘等呼吸系统疾病。课题组前期研究[2]亦证实其对哮喘动物模型的肺组织炎症和免疫失调有明显的抑制作用，本研究拟在此基础上进一步揭示其防治哮喘的作用机理，对哮喘的临床治疗意义重大。

1 材料与方法

1.1 动物SD 大鼠SPF 级雄性，体质量（160±10）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物质量合格证号：110322220102332836，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008。动物饲养于四川生物医药产业技术研究院，动物使用许可证号：SYXK（川）2020-199。动物饲养条件：自由进食、饮水，动物房温度：（23±2）℃，适应性饲养3 d。动物实验经四川生物医药产业技术研究院动物管理委员会批准，批准号：[2022]S-156。

1.2 药物芥子、炒芥子、醋延胡索、醋甘遂、细辛、生姜均从四川省中药饮片有限责任公司购买，批号分别为：211218、220108、220427、211213、220518、220521。将炒芥子∶醋延胡索∶醋甘遂∶细辛按2（生、炒各半）∶1∶1∶1 比例粉碎为细粉，过120目筛网混合，以新鲜生姜汁调成糊状制成伏九贴敷药物备用。地塞米松磷酸钠注射液，遂成药业股份有限公司，批号：22206071。

1.3 主要试剂Al（OH）3购于成都科隆化学品有限公司，批号：2021010801，用0.9%生理盐水配成10%佐剂备用。卵清蛋白（OVA）来自美国Solarbio 公司，货号：516S051，称取1 g OVA 溶于10%佐剂10 mL中，充分溶解备用；另将100 mg OVA 溶于生理盐水溶液10 mL中，充分溶解，即得1% OVA 溶液。枸橼酸抗原修复液（pH6.0）、Protein Phosphatase Inhibitor、Anti-IL-17 Rabbit pAb（稀释比1∶50），均购自武汉赛维尔生物科技有限公司，货号分别为：G1201、G2007-1ML、GB11110-1；Flow cytometry Staining buffer、Fix & Perm Kit、Anti-Rat CD25APC（Clone：OX39），杭州联科生物，批号：10432、A11224、AR02505；Rabbit Anti-Foxp3 antibody，北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-10211R，稀释比1∶100；Goat Anti-Rabbit IgG HRP，杭州联科生物技术有限公司，货号：GAR007，稀释比1∶200；FITC Anti-Rat CD4（domain 1）Antibody、EF Red 780 Anti-Rat CD3 Antibody和PerCP/Cyanine5.5 Anti-Rat CD8a Antibody，武汉Elabscience 生物科技有限公司，货号分别为：E-AB-F1105C、E-AB-F1228S、E-AB-F1098J；Foxp3 Monoclonal Antibody（FJK-16s）PE、Anti-Mo/Rt IL-17 PE，美国eBioscience 公司，货号分别为：12-5773-82、12-7177-81；BCA 试剂盒，安徽Biosharp公司，货号：BL521A；DAB显色剂，北京Solarbio公司，货号：DA1016；Beta Actin-Ab，江苏Affinity生物公司，货号：AF7018，稀释比1∶5 000；Rabbit Polyclonal to IL-2、IL-6、Phospho-STAT3、STAT3、Phospho-STAT5、STAT5 Ab，均来自美国Affinity 生物公司，货号分别为：DF6095、DF6087、AF3293、AF6294、AF3305、AF6305，抗体稀释比均为1∶1 000。

1.4 主要仪器2202030602型雾化机，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；DM0412S 低速离心机、D3024R台式高速冷冻离心机，美国SCILOGEX 公司；STP420 ES 组织脱水机、HM325 切片机，美国Thermo Fisher Scientific 公司；JB-P5 包埋机，武汉俊杰电子有限公司；Pannoramic SCANⅡ病理切片扫描仪，匈牙利3DHISTECH Kft 公司；CytoFLEX 流式细胞仪，美国Beckman coulter 公司；PowerPac Basic 电泳仪，美国Bio-Rad Laboratories 公司；μQuant 光谱仪，美国伯腾BioTek 公司；ChemiScope 6100 化学发光成像系统、ChemiScope 图像采集分析软件，上海勤翔科学仪器有限公司。

1.5 动物模型制备参考有关研究[3]方法，并进行改良后制备哮喘大鼠模型。于实验第1、7 天向大鼠腹腔注射含OVA（100 mg）、氢氧化铝（100 mg）的混合液1 mL 致敏。第15 天开始每天给予1% OVA 雾化激发，每天1 次，每次20 min，连续7 d。密切观察大鼠激发后的反应情况，以大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸频率加快、幅度加大、点头呼吸运动、腹肌痉挛、频繁挠鼻等典型哮喘样症状为激发成功。

1.6 分组、给药及标本采集将SD 大鼠按照随机数字表随机分为5组：正常组、模型组、假贴敷组、伏九贴敷组和地塞米松组，每组8只。除正常组外的各组大鼠均按“1.5”项下方法制备模型。正常组按同法在第1 天和第7 天时，于大鼠腹腔注射生理盐水1 mL；从第15 天开始，同法给予生理盐水雾化吸入，连续7 d。末次雾化结束后，假贴敷组和伏九贴敷组对取穴部位进行脱毛，第2天取调制好的伏九贴敷药物切成1 cm×1 cm，厚约0.3 cm 的块状，按照《实验针灸学》[4]取穴方法敷于伏九贴敷组大鼠大椎、肺俞（双侧）、肾俞（双侧）穴并用胶布固定，假贴敷组同样位置贴上无药空白胶布，均每次贴敷4 h，隔日贴敷1 次，持续14 d；地塞米松组大鼠腹腔注射地塞米松0.5 mg·kg-1，隔日1 次，共7 次；正常组和模型组不做任何处理。末次给药后第二天，腹主动脉取血处死，血液室温静置20 min，以3 500 r·min-1离心10 min（离心半径6 cm），分离血清，-20 ℃保存；分离肺组织，取右肺，-80 ℃保存。

1.7 肺组织中Th17 细胞因子IL-17 和Treg 转录因子Foxp3 阳性表达的检测取右肺4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片；脱蜡至水；柠檬酸修复缓冲液抗原修复；放入3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶；3%山羊血清封闭；滴加按工作稀释比配好的一抗4 ℃孵育过夜；复温10 min，滴加相应种属的二抗（HRP 标记，1∶200），37 ℃孵育30 min，显色；复染细胞核，脱水封片。显微镜镜检，随机选取200 倍视野进行拍照，Image-pro plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）进行图像采集分析，得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）。并求出平均光密度值（average optical density，AOD 值），AOD=IOD/AREA。AOD值越大表明阳性表达水平越高。

1.8 外周血中Th17、Treg 细胞比例的检测

1.8.1 Th17 细胞检测 取125 μL 肝素抗凝血至流式管中，加入125 μL 不含血清的培养基和1 μL PMA/Ionomycin Mixture（250×）和1 μL BFA/Monensin Mix⁃ture（250×）。以125 μL 抗凝血和125 μL 不含血清的培养基作为对照。混匀，37 ℃孵育4 h。然后取100 μL转移至新的流式管中，加入5 μL ER780 Anti-Rat CD3 Antibody和5 μL PerCP/Cyanine5.5 Anti-Rat CD8a An⁃tibody室温避光孵育15 min。加入100 μL固定破膜剂A 孵育破膜15 min，加入2 mL 流式染色缓冲液，以300×g离心5 min，弃上清。加入100 μL 固定破膜剂B 和5 μL Anti-Mo/Rt IL-17 PE 再次孵育15 min，离心，去上清。加入500 μL 染色缓冲液重悬后上机检测。

1.8.2 Treg 细胞检测 取100 μL 肝素抗凝血于流式管中，加入5 μL FITC-CD4 抗体和5 μL CD25-APC 抗体，4 ℃避光孵育30 min。加入2 mL 红细胞裂解液4 ℃避光孵育10 min；裂解后加入10 mL 的PBS 终止裂解，以4 ℃、300×g离心5 min，弃上清。用1 mL固定破膜剂室温孵育30 min，然后加入2 mL 破膜缓冲液终止破膜，4 ℃、300×g离心5 min，去上清。用100 μL 破膜缓冲液重悬沉淀，细胞悬液中加入2 μL正常大鼠血清进行阻断，再加入5 μL Foxp3-PE mAb孵育至少30 min，离心，弃上清。以500 μL 染色缓冲液重悬，上机检测。

1.9 肺组织中IL-6、IL-2、STAT3、p-STAT3、STAT5、p-STAT5 蛋白量的检测肺组织用RIPA匀浆裂解，提取总蛋白，以4 ℃、12 000×g离心5 min，收集上清。BCA 法测定蛋白浓度。取蛋白样品加入相应量的5×SDS 上样缓冲液，120 V 电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，200 mA 恒流转膜1 h。用5%的脱脂牛奶（TBST 配制），封闭1 h，按工作稀释比加入一抗，室温孵育3 h。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入稀释好的二抗，室温孵育1 h后再次洗膜3 次，然后用ECL 发光底物显影。采集图像，ChemiScope analysis软件进行灰度分析。

1.10 统计学处理方法采用SPSS 23.0软件进行统计检验。所有计量资料服从正态分布，数据以（±s）表示，多组间样本均数采用单因素方差分析进行统计分析，多重比较时如果方差齐采用LSD 检验；方差不齐则用Dunnett’s T3 检验。以P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织IL-17 和Foxp3 的阳性表达见图1、图2。肺组织切片免疫组化染色细胞核为蓝色，目的蛋白的阳性表达显棕黄色。造模后，较之正常组，哮喘模型组IL-17 高表达，平均光密度值（AOD 值）比正常对照组升高（P＜0.01）；而Foxp3 则低表达，AOD 值则比正常组降低（P＜0.01），差异均具有统计学意义。经治疗后，与模型组比较，伏九贴敷组和地塞米松组大鼠IL-17 的AOD 值明显降低（P＜0.01），Foxp3 的AOD 值明显升高（P＜0.05，P＜0.01），表明伏九贴敷药物和地塞米松使得哮喘大鼠肺中IL-17 的阳性表达量减少，而Foxp3 的阳性表达量增加。假贴敷组与模型组比较，两个指标的AOD值的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠肺组织中IL-17 的阳性表达（×200；±s，n=6）Figure 1 Positive expression of IL-17 assessed by immunohistochemistry in lung tissues of rats in each group（×200；±s，n=6）

图2 各组大鼠肺组织中Foxp3 的阳性表达（×200；±s，n=6）Figure 2 Positive expression of Foxp3 assessed by immunohistochemistry in lung tissues of rats in various groups（×200；±s，n=6）

2.2 各组大鼠外周血中Th17 和Treg 细胞比例由图3、图4 可以看出，模型组大鼠血中Th17 细胞百分比较正常组大鼠明显增加（P＜0.01），Treg 细胞百分比较正常组明显减少（P＜0.01），提示哮喘大鼠出现Th17/Treg 向Th17 偏移的现象。药物干预后，伏九贴敷组和地塞米松组大鼠血中Th17 细胞比例较模型组降低（P＜0.01），而Treg细胞百分比较模型组升高（P＜0.01），差异均有统计学意义。假贴敷组与模型组比较，Th17 和Treg 细胞所占比例的差异没有统计学意义（P＞0.05），说明未加药的空白胶布贴敷对哮喘大鼠Th17/Treg细胞比例没有影响。

图3 各组大鼠外周血中Th17 细胞百分比（±s，n=6）Figure 3 Percentage of Th17 cells detected by flow cytometry in peripheral blood of rats in different group（±s，n=6）

图4 各组大鼠外周血中Treg 细胞百分比（±s，n=6）Figure 4 Percentage of Treg cells detected by flow cytometry in peripheral blood of rats in each group（±s，n=6）

2.3 各组大鼠肺组织IL-6/STAT3 和IL-2/STAT5

通路相关蛋白表达如图5 显示，模型组大鼠肺中IL-6、p-STAT3相对蛋白表达水平明显高于正常对照组（P＜0.01），而IL-2、p-STAT5 相对表达水平明显低于正常组（P＜0.01）。给药后，与模型组比较，伏九贴敷和地塞米松组的IL-6、p-STAT3 表达水平明显降低（P＜0.01）；伏九贴敷组IL-2 和p-STAT5 的表达水平明显增高（P＜0.01），但地塞米松组IL-2 和p-STAT5 的表达较模型组的差异没有统计学意义（P＞0.05）。假贴敷组较之模型组，各指标的差异没有统计学意义（P＞0.05）。此外，STAT3 和STAT5 总蛋白的表达水平各组间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。

图5 各组大鼠肺组织IL-6、IL-2、STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5 的相对蛋白表达（±s，n=3）Figure 5 Relative protein expression of IL-6，IL-2，STAT3，STAT5，p-STAT3 and p-STAT5 analyzed with Western Blot in lung tissues of rats in each group（±s，n=3）

3 讨论

哮喘一直是现今社会一个主要的公共卫生负担，影响着全球近3.5 亿人，其患病率正在稳步上升[5]。哮喘的特点表现为伴随气道炎症的支气管高反应性，属于2型免疫反应[6-7]，其病因多种多样，病理生理复杂。人们普遍认为许多免疫细胞，特别是活化的T细胞亚型，释放细胞因子并共同作用，导致哮喘的主要症状[8]。辅助T（Helper T，Th）细胞在免疫功能紊乱中起着至关重要的作用，它促进了哮喘的发展[9]。曾经的主流观点一度认为Th2 优势分化的Th1/Th2 失衡是哮喘发病的一个重要的免疫学机制。然而Th 细胞类型众多，取决于微环境中的细胞因子，原生CD4+T 细胞可以分化为不同的效应亚群，如Th1、Th2、Th17 细胞[10]。我们对CD4+T 细胞分化的认识已经发生了明显的变化，新的亚群，如CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+T reguLatory cell，Treg）也逐渐被认知[11]。近年来，Th17 和Treg 的发现使得现有的Th1/Th2 平衡模式并不能完全解释哮喘的发病机制，这也拓宽了我们对过敏性疾病致病机理的理解[12]。Th17细胞是与以Th2 为主的变态反应性疾病息息相关的，在哮喘、过敏性鼻炎等疾病中均发现Th17 应答增强[13-14]。Treg 细胞作为自身免疫疾病的负调控因子，在维持自我耐受性方面发挥着关键作用，可诱导产生抑制性细胞因子TGF-β 和IL-10，防止炎症浸润和组织损伤[15]，对抑制过敏性哮喘炎症至关重要[7]。由此可见，Th17 和Treg 细胞的平衡对维持免疫内环境的稳定起重要作用，Th17/Treg 的失衡也是哮喘发病机制的重要病理生理基础。因此，恢复Th17/Treg 免疫平衡是治疗哮喘的关键，目前已成为研究领域的热点。本研究以OVA+Al（OH）3联合致敏复制大鼠哮喘模型，造模后流式细胞分析发现，哮喘大鼠外周血中Th17细胞百分比升高，而Treg细胞百分比下降，出现了Th17 分化占优的Th17/Treg 失衡现象。给药后，伏九贴敷药物使得大鼠血中Th17、Treg 细胞比例一降、一升，促进Th17/Treg 细胞趋于平衡，从而使哮喘大鼠Th17/Treg 失衡状态得到一定的纠正。但是，伏九贴敷药物重塑Th17/Treg 平衡的具体机制尚不明确，本研究试图以IL-6/STAT3 和IL-2/STAT5信号通路为切入点进一步探索伏九贴敷药物调控Th17/Treg免疫平衡的抗哮喘作用机制。

CD4+T 细胞向Th17 细胞的分化依赖于细胞因子的类型和数量（或暴露于细胞因子的程度）[16]。活化的CD4+T 细胞能分泌细胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6[17]。多效性细胞因子IL-6 对于Th17 细胞的分化以及致病性Th17 和保护性Treg 之间的平衡至关重要[18]。信号转导器和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一种潜在的转录因子，通过与细胞表面的多肽受体相互作用来转导细胞外信号。翻译后主要通过酪氨酸磷酸化激活，形成STAT3 二聚体，从细胞质转移到细胞核，并与靶基因的序列特异性DNA 元素结合而持续表达[19]。IL-6 可驱动STAT3 的磷酸化，进而激活Th17特异性转录因子维A 酸相关孤儿受体γt（retinoic acid related orphan receptor γt，RORγt），最终促进Th17分化[20]。由此可见，IL-6/STAT3 信号通路在诱导Th17细胞分化中扮演着重要角色。

在抗原的刺激和激活下，Th17 细胞分泌促炎因子，如IL-17，它参与了成纤维细胞、气道平滑肌细胞的增殖和活化，也参与了IL-8/CXCL-1 趋化因子的释放，这些都利于造成气道重塑损伤和气道高反应而促进炎症反应，并吸引中性粒细胞进入气道[21]。基于越来越多的报道Th17 细胞与哮喘炎症反应有关的证据，我们研究了在伏九贴敷治疗过程中伏九贴敷药物对Th17 细胞分化的影响。本研究中，我们发现伏九贴敷药物显著抑制了细胞因子IL-6 的表达，使得STAT3（Th17 细胞中的一种主要转录因子）磷酸化驱动不足，p-STAT3 表达被抑制，不能正常活化RORγt 受体以诱导Th17 分化。这一发现证实了伏九贴敷药物可以通过抑制Th17 的转录来抑制Th17 细胞的分化，而促炎因子IL-17 的阳性表达数量亦随之减少，这些都有助于哮喘炎症反应的缓解。

与Th17 相反，Treg 细胞是免疫耐受和预防自身免疫性疾病的主要参与者。在各种炎症和自身免疫性疾病中，Treg的数量和活性降低。正是鉴于Treg细胞在控制免疫应答中的关键作用，调节这些细胞的分化已被推荐作为治疗和限制自身免疫性和慢性炎症性疾病的一种方法[22]。Tregs 特异性表达转录因子叉头盒P3（forkhead box P3，Foxp3）是Treg 分化和功能的主要调节器。Foxp3 缺乏可导致全身性自身免疫[23]。多种分子涉及Treg 细胞介导的免疫抑制机制，包括IL-2 和TGF-β。IL-2 是参与控制Treg 细胞存活，并维持其功能和稳态的关键细胞因子[24]。Treg 高表达高亲和力IL-2受体（IL-2R），当IL-2与IL-2R结合时，诱导信号级联反应，引起转录因子STAT5 的磷酸化和激活[25]。既往研究[26]就有报道，IL-2 通过STAT5 信号通路调控人CD4+CD25+Treg 细胞中Foxp3的表达，并参与外周Treg 细胞的生成、功能和稳定。Park 等[27]也指出人参能上调环孢霉素处理的脾细胞中的STAT5 磷酸化水平以促使Treg 分化。从这些证据可以看出，STAT5 信号通路通过促进Foxp3 的表达并抑制IL-17 等促炎细胞因子的产生影响T 细胞分化和免疫稳态[28]。近年来，有研究[29]提出了Th17 细胞和Treg 相互调控的一个竞争模型，在该模型中，STAT3和STAT5的相对激活直接决定了CD4+T细胞中IL-17的产生结果。该项研究指出STAT3 和STAT5 都是与编码IL-17 的位置上的多个共同位点结合的，并且IL-2 诱导的STAT5 和这些位点的结合是和STAT3 在这些位点的结合较少有关。因此，抑制STAT3 的治疗药物可能同时上调STAT5 表达。本研究结果显示，伏九贴敷药物治疗后使得哮喘大鼠肺组织中IL-2 表达增加，提高了STAT5（Tregs 中的一种转录因子）磷酸化水平，p-STAT5 表达上调，同时，Foxp3 的阳性表达量也升高了。Foxp3 和STAT5 都是Treg 细胞中的关键转录因子，它们的表达上调增加了表达Foxp3 和STAT5 的Treg 细胞比例，减少的CD4+CD25+Foxp3+Treg 群体的表达得以恢复，而哮喘大鼠中出现的Th17 优势分化被抑制，Th17/Treg 免疫细胞在伏九贴敷药物作用下趋于平衡。上述结果表明，在伏九贴敷治疗过程中伏九贴敷药物通过相互调节Th17 和Treg细胞而取得有益抗哮喘的效果。

综上所述，伏九贴敷药物通过调节Th17/Treg 平衡增强机体免疫耐受，减轻大鼠对哮喘的免疫应答，从而发挥抗哮喘效应，其机制可能与抑制IL-6/STAT3 信号通路，减少Th17 免疫细胞分化；同时激活IL-2/STAT5 通路，促进Treg 细胞分化有关。这一发现为伏九贴敷疗法有效缓解哮喘症状，减少发作次数，增强患者抵抗力的临床应用提供了实验依据。