超声波辅助酶提取结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定富硒蔬菜中硒形态

2024-02-02李倩刘兴勇陈兴连罗兰尹本林李新宇杜丽娟王云美

食品与发酵工业 2024年2期

李倩,刘兴勇,陈兴连,罗兰,尹本林,李新宇,杜丽娟*,王云美*

1(云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所,云南昆明,650205) 2(云南省产品质量监督检验研究院,云南昆明,650223)

硒在碘甲状腺原氨酸脱碘酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还原蛋白酶等多种酶中发挥重要的生理作用,包括代谢重金属、抗癌、抗氧化、增强免疫力等,是人体健康的关键元素和营养素[1-3]。人体对硒的需求量范围不宽,摄入过多会硒中毒,摄入不足可引起肿瘤、心血管疾病、大骨节病、胰腺纤维化、关节炎、白内障等疾病[4-5]。硒的生物利用度和毒性不仅与硒的总量有关,还取决于硒的化学形态以及浓度[6-7],人体所需要的硒元素主要以有机硒存在,无机硒不易被人体吸收[8]。硒在我国分布不均衡,缺硒地区的人群面临硒摄入不足的风险,此外,硒主要以无机硒的形态存在于土壤以及水中。面对以上难题,近年来富硒食品应运而生,其中富硒蔬菜产业快速发展,市场上出现了大量的富硒蔬菜,但富硒蔬菜质量参差不齐,存在以无机硒冒充有机硒的乱象,对富硒蔬菜中硒含量及形态鉴定迫在眉睫。

硒形态分析通常采用色谱法分离,原子光谱法检测,而高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[9-10](high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)具有检出限低、分离能力好、分析精度高,线性范围宽等特性现已成为测定硒形态的主要方法。目前,硒形态测定研究主要集中于谷物[11]、土壤[12]、水[13]、大米[14]等,多采用恒温水浴酶提取,提取时间较长,且多采用原子荧光光谱法检测,检出限较高。超声波辅助酶提取法能够更好地破坏植物的细胞壁,有效分散被提取物,促进被提取物与蛋白质、纤维素等大分子分离,现在利用超声波辅助酶提取法结合HPLC-ICP-MS检测富硒蔬菜的研究报道仍较少。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

Ultimate3000-iCAPRQ型超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪,美国Thermo Fisher公司;BINDER FD 115电热鼓风干燥箱,美国BINDER公司;KQ-500E超声波清洗器,昆山市超声仪器公司;SHA-BA型水浴恒温振荡器,江苏科析仪器有限公司;GL-88B型旋涡混合器,江苏海门市英林贝尔仪器制造有限公司;SWT 2240电子天平(感量为0.1 mg),北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 试样处理

将样品用蒸馏水清洗,冷冻干燥后使用粉碎机将样品粉碎,过100目筛,收集备用。

1.3.2 样品的提取

称取约0.2 g外源硒处理蔬菜样品于10 mL塑料离心管中,加入4 mg蛋白酶XIV,加入5 mL水(氨水调节pH值为7.5),在37 ℃超声波提取80 min,高速离心10 min,取下层清液,过0.25 μm水相滤膜,上机测定。

1.3.3 标准溶液的配制

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

Hamilton PRP-X100色谱柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);淋洗液:25 mmol/L柠檬酸溶液(pH 6.5);洗脱方式:等度洗脱;流速:1 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:50 μL;洗脱时间:10 min。

1.4.2 ICP-MS 工作条件

射频功率1 548 W;雾化室温度2 ℃;载气流量0.5 L/min;辅助气流量0.1 L/min;载气:高纯氩气;采样深度:8.0 mm。

2 结果与分析

2.1 样品提取条件的优化

2.1.1 提取方式的影响

朱羽庄等[16]在测定海产品中硒形态时在50 ℃、180 r/min的条件下酶解12 h,王欣等[17]在测定富硒食品也是在恒温摇床上酶解提取7 h,提取时间较长,而MOREDA-PIEIRO等[18]发现采用超声波酶解提取方法可以缩短提取时间。硒形态提取的关键在于酶,但酶提取时间较长,超声波产生的空化作用可以增强酶与细胞基质之间的碰撞,从而改善酶与底物的相互作用,可以缩短提取时间。本文对2种提取方式进行了实验对比,结果如图1所示,从结果看出2种提取方式对富硒蔬菜的提取结果相差不大,但恒温振荡酶解提取耗时较长,超声波辅助酶提取缩短了提取时间,所以对于蔬菜样品采用超声波辅助酶提取效果最佳。

图1 不同提取方式对比图Fig.1 The contrast of different extract methods

2.1.2 提取酶种类的影响

硒在生物体中主要以有机硒存在,与蛋白质、多肽等大分子结合在一起,张泽洲等[19]报道采用酶解的方法提取效率更高。酶作为一种催化剂,具有活性位点,但不同的酶活性位点不同,基质不同的样品,结合点也不同,所以提取能力存在差异。本文分别考察了蛋白酶XIV、木瓜蛋白酶对提取结果的影响,从图2中可以看出不同蛋白酶对SeMet的提取影响较大,当使用蛋白酶XIV时大大增加了SeMet的提取效率,所以选择蛋白酶XIV作为提取酶。朱羽庄等[16]发现使用木瓜蛋白酶和蛋白酶XIV在提取海产品中硒形态效率相差不大,此处提取差异较大的原因可能是所用木瓜蛋白酶的酶活力较低。由于蛋白酶XIV的最适温度在37 ℃,所以样品提取温度为37 ℃。

图2 不同提取酶对比图Fig.2 The contrast of different extraction protease

2.1.3 蛋白酶XIV用量的影响

图3 蛋白酶XIV用量对提取结果的影响Fig.3 Effect of the amount of protease XIV on extraction results

2.1.4 提取时间的影响

2.1.5 提取液pH的影响

提取液的pH值对提取效率也会有影响,因为pH影响蛋白酶的活性,而蛋白酶的活性影响着与底物的相互作用,从而对提取结果产生影响。试验考察了提取液pH对提取结果的影响,分别用氨水调节pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的提取液,其结果如图5所示,随着pH从6.0升至7.5,提取含量逐渐升高,而pH从7.5到9.0,提取含量又逐渐降低,所以最佳pH值为7.5,而7.5刚好与蛋白酶XIV的最佳pH值接近。

图4 提取时间对提取结果的影响Fig.4 Effect of the extraction time on extraction results

图5 提取液pH对提取结果的影响Fig.5 Effect of pH of extraction solution on extraction results

2.2 淋洗液条件的优化

2.2.1 淋洗液浓度的影响

图6 不同淋洗液浓度下标准样品色谱图Fig.6 Chromatograms of standard samples in different concentration of eluent

2.2.2 淋洗液pH的影响

图7 不同pH淋洗液下标准样品色谱图Fig.7 Chromatograms of standard samples in different pH of eluent

2.2.3 淋洗液中甲醇添加剂的影响

图8 淋洗液中添加甲醇的标准样品色谱图Fig.8 Chromatograms of standard samples in different additions of methanol

2.3 标准曲线与检出限

表1 五种硒形态的线性测试结果Table 1 Linear test results of 5 kinds of selenium species

2.4 回收率和精密度

称取0.2 g硒处理菠菜叶,定量加入不同水平标准品,每个梯度6个平行样品,采用优化后方法处理后测定其加标回收率。结果表明,平均回收率在96.3%～104.2%,相对标准偏差在7.6%以下,符合定量分析的要求,结果见表2。与倪张林等[21]测定富硒蔬菜的方法相比,其回收率为80.1～99.2%,相较而言,本研究回收率更高。