楚雄南苜蓿根瘤菌的鉴定及其耐酸耐铝特性研究

黎梅杰 段正山 邓宗澳 罗富成 段新慧 韩博

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.009

引用格式：

黎梅杰， 段正山， 鄧宗澳，等.楚雄南苜蓿根瘤菌的鉴定及其耐酸耐铝特性研究［J］.草地学报，2024，32（1）：87-95

LI Mei-jie， DUAN Zheng-shan， DENG Zong-ao，et al.Identification of Rhizobium of Medicago Polymorpha L. and Its Resistance to Acid and Aluminum［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：87-95

摘要：为了获得耐酸铝性强的楚雄南苜蓿（Medicago polymorpha L.）共生根瘤菌菌株，本研究对从不同地区采集到的5份根瘤样品进行分离、纯化和鉴定。对鉴定得到的根瘤菌进行菌体形态观察、低氮回接以及耐酸、铝特性的研究。结果表明：YS-8，YS-10，DH-9，DH-31属于根瘤菌属根瘤菌、CX-44属于中华根瘤菌属苜蓿中华根瘤菌，5个菌株均符合根瘤菌基本形态特征。接种5株根瘤菌后，楚雄南苜蓿的干重、鲜重、株高、结瘤数均显著高于对照（P＜0.05）；pH值在4.5～7.5范围内，5株菌株均能正常生长，当pH值=3.5时，5株菌株全部死亡；当Al3+浓度在100～1 500 mg·L-1之间，随着Al3+浓度的升高，菌株生长逐渐缓慢，Al3+浓度达到2 000 mg·L-1时，5株菌株全部死亡。分离出的5株根瘤菌均能与楚雄南苜蓿共生结瘤并促进其生长，且具有较强的耐酸铝性。筛选出的5株根瘤菌均能在pH值大于3.5且铝离子浓度（pH值=5）小于1 500 mg·L-1的条件下推广使用，菌株CX-44的效果最佳。

关键词：酸性土壤；楚雄南苜蓿；共生根瘤菌；抗酸铝菌株

中图分类号：S153.6    文献标识码：A      文章编号：1007-0435（2024）01-0087-09

Identification of Rhizobium of Medicago Polymorpha L. and

Its Resistance to Acid and Aluminum

LI Mei-jie1， DUAN Zheng-shan2， DENG Zong-ao1， LUO Fu-cheng1， DUAN Xin-hui1*， HAN Bo1*

（1. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan Province 650201， China;

2. Agricultural and Rural Service Center of Caiyun Town， Lufeng City， Lufeng， Yunnan Province 651219， China）

Abstract：In order to obtain the strains of symbiotic rhizobium of Medicago polymorpha L. with strong acid and aluminum resistance，five nodule samples collected from different regions were isolated，purified and identified. The identified rhizobia were studied for bacterial morphological observation，low nitrogen backconnection，acid resistance and aluminum resistance. The results showed that YS-8，YS-10，DH-9 and DH-31 belonged to Rhizobium sp，CX-44 belonged to Sinorhizobium medicae，and the five strains all conformed to the basic morphological characteristics of rhizobia. After inoculation with 5 rhizobia strains，the dry weight，fresh weight，plant height and nodulation number of Medicago polymorpha L. were significantly higher than those in the control;In the range of 7.5～4.5 pH，all 5 strains growed normally，and when pH was 3.5，all 5 strains died;When Al3+ concentration was between 100～1 500 mg·L-1，the growth of the strains gradually slowed down as the Al3+ concentration increased，and when the Al3+ concentration reached 2 000 mg·L-1，all 5 strains died. The isolated five rhizobia strains could coexist with Medicago polymorpha L. and promote their growth，and had strong acid aluminum resistance. The five screened strains of rhizobia could be popularized and used under the condition of pH greater than 3.5 and aluminum ion concentration （pH=5） less than 1 500 mg·L-1，and the strain CX-44 was the best.

Key words：Acidic soil;Medicago polymorpha L.;Symbiotic rhizobia;Acid-fast aluminum strains

收稿日期：2023-06-15；修回日期：2023-10-19

基金项目：云南省基础研究面上项目（202101AT070206）；国家自然科学基金青年基金（32301489）；洱源县饲草产业科技特派团（202304BI090008）资助

作者简介：

黎梅杰（1997-），女，彝族，云南文山人，硕士研究生，主要从事草类种质资源与利用研究，E-mail：2293585796@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：xinhuiduan@aliyun.com；hanbo1983@126.com

随着我国南方畜牧业的快速发展，优质豆科牧草的重要作用已引起重视，但由于南方土壤大多偏酸性，从而使紫花苜蓿（Medicago sativa）等优质豆科牧草的推广种植受到极大的限制，不能满足南方畜牧业的快速发展。因此，迫切的需要挖掘耐酸性较强的豆科牧草资源或找到提高豆科牧草耐酸性的方法，以满足畜牧业的快速发展。楚雄南苜蓿（Medicago polymorpha L.）是豆科苜蓿属一年生或越年生草本植物，是能在酸性土壤中快速生长的优质豆科牧草之一［1］。作为云南省地方豆科牧草品种，楚雄南苜蓿已有60多年的栽培种植历史，具有饲用价值高、固氮能力强、耐寒、耐旱、耐酸铝等特点［2-4］，为畜牧业的发展做出巨大的贡献［5-6］。楚雄南苜蓿能在酸性土壤中生长发育，除了与本身具有较强的耐酸、铝性有关外，还与其共生根瘤菌具有较强的耐酸铝性，能在酸性条件下存活并发挥共生固氮作用有很大的关系。

根瘤菌是与豆科植物结瘤的共生固氮细菌的总称，根瘤菌共生有利于豆科牧草在逆境条件下的结瘤固氮和生长发育［7-9］，从而增加植株生物量、粗蛋白含量及叶片中氮、磷等的含量。有大量研究表明，在酸、铝胁迫下豆科牧草接种根瘤菌有利于共生系统的形成，可以促进牧草的生长并提高其产量和品质［10-13］，是提高豆科牧草在酸性土壤中生长最经济有效的途径。因此筛选酸性条件下耐铝共生根瘤菌，是推动楚雄南苜蓿推广种植及提高牧草耐酸铝性的关键因素。本研究从云南省楚雄州、文山州、德宏州三个地方采集到5份楚雄南苜蓿根瘤样品，并对其进行分离和纯化，利用分子鉴定和水培回接技术确定其共生根瘤菌菌株，并在此基础上研究这些候选根瘤菌的耐酸、铝特性，为楚雄南苜蓿在南方酸性土壤中的推广利用及其他豆科牧草共生根瘤菌的选育提供理论和技术支撑。

1  材料与方法

1.1  根瘤采集地点

楚雄南苜蓿根瘤样品分别采自云南省楚雄州、文山州和德宏州。

1.2  根瘤样品采集及保存方法

于楚雄南苜蓿初花期采集新鲜健壮、颜色鲜艳的根瘤，剪时稍带一段根，编号并记录采集时间、地点，将采集样品放于25%甘油管中密封，4℃冰柜中冷藏保存备用。

1.3  根瘤菌株的分离纯化

用剪刀将新鲜的根瘤（带部分根）从根部分离，用水多次冲洗后，使用NaClO灭菌3分钟，75% 乙醇灭菌5 min，无菌水冲洗10次后，在无菌条件下，用镊子将根瘤压碎，挤出汁液涂布在酵母甘露醇瓊脂（Yeast mannitol agar，YMA）固体培养基上，28℃倒置培养 3～4 d。挑取乳白色、粘稠状的菌落，采用划线分离法直至获得单菌落，观察记录菌的形态、大小、透明度、粘稠度、颜色等［14］。

1.4  根瘤菌菌株的鉴定

1.4.1  根瘤菌菌株的 16S r RNA基因序列比对及系统发育分析  根瘤菌DNA的提取：测试菌株在酵母甘露醇肉汤（Yeast Extract Mannitol Broth，YMB） 液体培养基中震荡培养（3～5 d） 至对数期，按照Wilson［15］的方法提取DNA，将在1%琼脂糖凝胶上检测合格的PCR产物送至上海生物工程公司测序。

使用DNAMAN将测序结果拼接完整，登录NCBI，将合格的16S rRNA序列及其他信息提交GenBank，录入数据库。在GenBank中查找下载相似性高的菌株序列，而后用MEGA11软件进行序列比对及系统发育树的构建，系统发育树的构建采用邻接法［16-18］。

1.4.2  根瘤菌株的形态学鉴定  在YMA平板上28℃培养 72 h后观察菌落形态特征；参照李旭东［19］的方法进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察菌体形态、大小，并利用MvImage vt软件照相，电镜扫描由塞维尔公司使用扫描电镜HITACHI Regulus 8100完成。

1.4.3  低氮水培回接  楚雄南苜蓿种子用75%酒精灭菌后进行催芽，当胚根长至3～5 cm时将幼苗移植于装有低氮营养液的试管（3 cm×22 cm）中，每个试管中移植3株，当幼苗长出第一片真叶时，接种1.5 mL OD值≈0.8的根瘤菌培养液［20-21］，以不接种为对照，每个菌种设置3个生物学重复，定期补充低氮营养液，培养45 d后测定植株鲜重、干重、株高、根长和结瘤数。

1.5  耐酸耐铝根瘤菌菌株的特性研究

1.5.1  共生根瘤菌的耐酸性研究  将5株根瘤菌分别接种于pH=7的YMA液体培养基中培养活化，调节根瘤菌培养液OD值为0.8 后，分别取 2.5 mL菌液接种于不同pH值（7.5，6.5，5.5，4.5，3.5）条件下的YMA液体培养基中，在28℃恒温条件下振荡培养，培养期间每 12 h测一次培养液OD值，连续培养 72 h，并绘制生长曲线图，判断根瘤菌生长情况［22-23］。用1% HC1溶液和NaOH溶液调节YMA液体培养基pH值。

1.5.2共生根瘤菌的耐铝性研究  在pH=5条件下，不同Al3+浓度（0，100，500，700，1 000和1 500 mg·L-1）对其生长的影响。根瘤菌的活化、接种、培养与OD值的测定及YMA液体培养基pH值的调节同1.5.1。

1.6  数据分析

采用Excel 2010整理数据，Origin2018绘制图表，SPSS 18.0进行统计学分析，MEGA软件构建系统发育树。

2  结果与分析

2.1  根瘤菌菌株的种类鉴定

分离培养的楚雄南苜蓿根瘤菌的种属鉴定结果见表1：在44个菌株中共鉴定出根瘤菌5株，其余39个菌株为与根瘤菌一起共生的根瘤内生细菌，分属10个属24个种，分别为Klebsiella（克雷伯氏菌属）、Bacillus（芽孢杆菌属）、Enterobacter （肠杆菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Erwinia（欧文氏菌属）、Paenibaciiius （类芽孢杆菌属）、Arthrobacter（节杆菌属）、Burkholderia（伯克霍尔德氏菌属）、Acinetobacter（不动细菌属）、Sinorhizobium（中华根瘤菌属）。利用MEGA11.0软件对5株代表菌株和模式典型菌株的16S rDNA序列进行Neighbor-Joining分析，在GenBank中下载的模式菌株与供试菌株相似性和同源性都达到99%。由图1可知：所有供试菌株和参比菌株在系统发育上分为两大分支，菌株DH-31和菌株CX-44在系统发育上共同构成一个分支，分别与模式菌株Rhizobium sp. KC243305.1和Sinorhizobium medicae KR827437.1以100%的相似性聚在一起，菌株DH-9和YS-8，YS-10共同构成一个分支，其中DH-9与模式菌株Rhizobium sp. KJ184944.1以98%的相似性聚在一起构成一个小分支，YS-8，YS-10分别与模式菌株Rhizobium sp.MT974183.1：1-1379，Rhizobium sp.MT974183.1：1-1379以76%和86%的相似性聚在一起构成一个小分支。说明菌株CX-44属于根瘤菌科根瘤菌属苜蓿中华根瘤菌，YS-8属于根瘤菌科根瘤菌属根瘤菌，YS-10，DH-9，DH-31属于根瘤菌科根瘤菌属根瘤菌。

2.2  菌株形态特征观察

对分离鉴定出的5株根瘤菌进行染色和培养后，观察各菌株的菌体形态特征。观察发现，在YMA培养基上培养 3 d可形成直径 0.3～0.9 cm的菌落，菌落为圆形，表面凸起光滑，半透明，边缘整齐（图2）。5株菌株菌体形态均为短杆状，革兰氏染色阴性，鞭毛侧生或顶生，能运动，长短各不相同，菌体表面有荚膜或无荚膜，符合根瘤菌的基本形态特征（图3，图4）。

2.3  低氮回接实验

用5株根瘤菌回接楚雄南苜蓿后，均能使南苜蓿结瘤，而未接种的植株（CK）上未发现根瘤，证明这5株根瘤菌均为南苜蓿共生根瘤菌。如表2所示，接种5株根瘤菌40 d后南苜蓿干重、鲜重、株高、结瘤数均显著高于CK（P<0.05），但CK的根长显著高于接种菌株；接种菌株CX-44后，除根长外，南苜蓿干重、鲜重、株高等指标均显著高于CK和其它几种菌株（P<0.05）。

由图5、图6所示，与接种根瘤菌的植株相比，未接种根瘤菌的植株在低氮情况下生长较缓慢，且叶片逐渐枯萎变黄，植株较矮小，主根長，侧根少，接种根瘤菌的植株叶片颜色更绿，生长更快，植株更繁茂，根系更为发达，侧根明显多于CK。

2.4  根瘤菌在不同酸性条件下的生长特性

不同pH值条件下鉴定出的5株根瘤菌的生长曲线如图7所示，pH=7.5，6.5，5.5，4.5时5株菌株均有迟缓期、对数期生长期、稳定期、衰退期，符合根瘤菌的生长规律，5株根瘤菌的OD值均在pH=3.5时接近0，pH=7.5时5株菌株的OD值相差不大，但CX-44的值要稍大于其他4株，pH=6.5时YS-10和DH-31达到稳定期时的OD值较大，但达到衰退期后相差不大，pH=5.5时，5株菌株稳定期的OD值相近，pH=4.5时，CX-44，DH-31和YS-10在稳定期的OD值大于其他菌株。说明5株根瘤菌均有较强的耐酸性，其中YS-10，DH-31，CX-44表现比较突出。

2.5  酸性条件下根瘤菌在不同铝浓度下的生长特性

不同铝离子浓度下根瘤菌的生长特性如图8所示，在铝离子为100～1 000 mg·L-1范围内，5株根瘤菌均能完成生长，且具有明显的迟缓期、对数期生长期、稳定期和衰退期，铝离子为1 500 mg·L-1时，5株根瘤菌的OD值都小于0.2，2 000 mg·L-1时5株根瘤菌OD值接近0。铝离子为500 mg·L-1时，稳定期时DH-9和CX-44的OD值较大，YS-8的OD值较小，当铝离子升至700 mg·L-1和1 000 mg·L-1时，稳定期CX-44的OD值明显高于其余4株根瘤菌，而菌株YS-8，DH-9，YS-10，DH-31的OD值相差不大，说明5株菌株均有较强的耐铝能力，其中分离自楚雄的南苜蓿根瘤菌CX-44耐铝能力最好。

3  讨论

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，对微生物的鉴定技术已不再局限于形态学、细胞组分和生理生化特性等鉴定，而是深入到核酸水平，在分子水平上实现了根瘤菌的快速鉴定，为根瘤菌的鉴定及应用提供理论依据［24］。因此本研究利用16SrRNA基因测序技术对分离出的根瘤菌进行测序并在基因库中进行比对鉴定，16SrRNA基因序列分析表明分离纯化得到的菌株多数为除根瘤菌以外的细菌，说明在楚雄南苜蓿根瘤内存在大量能与根瘤菌共生的细菌，这些细菌或许与根瘤菌的共生固氮功能息息相关，而是否对楚雄南苜蓿的固氮以及促进根瘤菌结瘤固氮发挥一定的作用还需进一步验证。国内外有对豆科根瘤中的细菌进行的研究报道［25-27］，研究表明植株根瘤中有多种具有固氮功能的微生物，如根瘤菌属微生物的土壤杆菌［28］、类芽孢杆菌和芽孢杆菌［29］等对豆科植物的增产增效起到重要的作用。

低氮回接实验是检测根瘤菌是否具有共生固氮能力常用的方法［30］，在对5株根瘤菌进行低氮回接实验时发现，未接种根瘤菌的植株并未发现根瘤，说明本实验排除了楚雄南苜蓿种子内存有根瘤菌而使实验结果出现误差的可能性。在低氮回接实验中发现，5株菌株均能与宿主结瘤固氮，接种根瘤菌后植株的株高、鲜重、干重都明显高于CK，说明接种根瘤菌能提高豆科牧草的固氮能力，促进牧草的生长并提高其产量，这与前人的研究一致［31］。分离自楚雄的菌株CX-44的回接效果要优于其余4株，说明不同的菌株的接种效果不同，有相关报道也表明了从同一宿主中分离得到的不同根瘤菌与宿主具有不同的共生能力［32-34］，因此筛选出与楚雄南苜蓿匹配、固氮能力好、竞争结瘤能力强的优良菌株，对促进楚雄南苜蓿及其它豆科牧草的推广种植具有重要意义。与接种根瘤菌的植株相比，未接种根瘤菌的植株在低氮情况下生长较缓慢，植株矮小且叶片逐渐枯萎，主根根长较长，侧根较少，无根瘤，说明在低氮状态下接种根瘤菌有利于楚雄南苜蓿侧根的发育，促使植物体结瘤从而固定更多的氮，供给植物体利用，从而促进楚雄南苜蓿生长发育，在对大豆和苜蓿接种根瘤菌的研究［35-36］中也表明了接种根瘤菌有利于植物根系的生长，这可能是因为豆科植物接菌使根系有較高固氮酶活性，加速根瘤菌活动和繁殖，促进根系生长，从而提高植株生长和发育［37-38］。

在本实验中筛选出的5株菌株均来源于呈酸性的南方土壤，在实验室条件下对5株菌株进行耐酸性研究表明：5株筛选与酸性土壤中的菌株能在pH值大于3.5的条件下生长，说明5株菌株具有较强的耐酸性，有研究也表明在酸性土壤中筛选出的根瘤菌具有较强的耐酸性［39-40］。虽然 5株根瘤菌的耐酸性相差不大，并且都有一定的耐铝能力，但在高浓度铝胁迫下根瘤菌CX-44的表现要优于其余4株，这说明具有耐酸性差异不大的根瘤菌，其耐铝毒能力可能有所不同，这与前人［41-42］研究具有一致性，这更加表明了在酸性条件下筛选出与豆科牧草共生固氮且具有较强耐铝菌株具有很大的价值。

4  结论

从三个不同地区采样鉴定后，得到5株根瘤菌菌株，YS-8，YS-10，DH-9，DH-31属于根瘤菌科根瘤菌属根瘤菌，CX-44属于根瘤菌科中华根瘤菌属苜蓿中华根瘤菌，其中CX-44为楚雄南苜蓿的优良高效共生菌株，具有较强的耐酸铝能力。研究发现，筛选出的5株根瘤菌能在pH值大于3.5且铝离子浓度（pH值=5）小于1 500 mg·L-1的土壤条件下推广使用，其中菌株CX-44的效果最佳。

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（责任编辑  刘婷婷）