IL-4、IL-13在大疱性类天疱疮患者血清和疱液中的表达

周瑶, 滕理君, 李帼敏, 徐洁, 郑金津, 房浩, 薛汝增

南方医科大学皮肤病医院,广东 广州 510091

大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid, BP)是一种好发于老年人的自身免疫性水疱病,80岁以上的患者BP发病率增加,每年有近150～330例新发病例,可能原因为人口老龄化、药物诱发,以及对非大疱性表现疾病诊断的改进[1]。BP常与老年人的多种合并症相关,特别是神经系统疾病和血栓形成风险增加,1年死亡率达23%[2-3]。患者的生活质量较健康人显著降低,瘙痒引起的睡眠障碍和烦躁感、创面糜烂带来的疼痛感以及导致的社交障碍被认为是BP患者抑郁指数得分较高的原因[4]。因此,越来越多的学者致力于BP的发病机制及治疗等方面的研究,以期帮助更多老年患者减轻病痛,改善晚年生活质量。目前有使用多西环素、氨苯砜辅助激素治疗的研究,也有应用生物制剂治疗的报道,包括利妥昔单抗、奥马珠单抗及度普利尤单抗等,旨在减少累积类固醇剂量和死亡率[5]。

BP的典型临床表现为荨麻疹样红斑、紧张性水疱,瘙痒剧烈,同时伴有血清总IgE和(或)外周血嗜酸性粒细胞水平的升高[6-8]。研究发现BP患者的血清和水疱液中产生IL-4和IL-13的细胞数量增加[9],而这两种细胞因子与2型炎症直接相关,提示BP可能存在2型炎症。此外,BP患者血清中存在针对表皮基底膜区结构蛋白BP180和BP230的循环自身抗体IgG,二者为BP的标志性抗体[10]。而抗BP180、BP230抗体在患者血清中可呈现单阳性、双阳性等不同表达。为此,本研究检测BP患者血清和疱液中的IL-4和IL-13表达情况,分析其与血清总IgE、外周血嗜酸性粒细胞、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分的关系,进一步探究BP中2型炎症的表达;同时探究不同抗体谱表达下,BP患者血清、疱液中IL-4、IL-13的表达含量是否存在差异,是否可借此指导BP患者进行分层治疗。

1 对象与方法

1.1 研究对象

BP患者血清、疱液样本均来自南方医科大学皮肤病医院皮肤科门诊及病房的确诊病例,纳入标准：①均具有BP典型临床表现,同时符合BP的组织病理学和免疫荧光特点,符合BP疾病的诊断标准[6];②抗BP180和抗BP230抗体谱为双阳性或单阳性(抗BP180抗体为阳性,抗BP230抗体为阴性);③不伴有其它自身免疫性、系统性或肿瘤性疾病;④近一个月内未进行系统性治疗,如口服糖皮质激素、免疫抑制剂等,以及未接受生物制剂治疗;⑤近2周内未进行局部治疗,包括外用药如糖皮质激素等或光化学治疗等。BP组共纳入49例,其中男29例,女20例;年龄 24～93 岁,平均(69.44±12.84)岁。49例患者中,12例同时具有血清、疱液样本;30例有血清、无疱液样本;7例有疱液、无血清样本。故患者总血清样本42个,总疱液样本19个。

对照组血清、疱液样本均来自本院皮肤科门诊招募健康人,纳入标准：①目前及既往均未患BP疾病;②无荨麻疹、特应性皮炎、湿疹、过敏性鼻炎、哮喘等慢性疾病病史;③不伴有其它自身免疫性、系统性或肿瘤性疾病;④近一个月内未进行系统性治疗,如口服糖皮质激素、免疫抑制剂等,以及未接受生物制剂治疗;⑤近2周内未进行局部治疗,包括外用药如糖皮质激素等或光化学治疗等。共纳入33例,其中男14例,女19例;年龄14～59岁,平均(32.09±11.00)岁。对照组33例中,24例有血清、无疱液样本;9例有疱液、无血清样本;无同时具血清、疱液样本者。故对照组总血清样本24个,总疱液样本9个。

两组间年龄(Z=3.53,P<0.01)有统计学差异;性别 (2=2.22,P=0.136)无统计学差异。研究经本院伦理委员会批准(2022129),所有受试者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器

Human IL-4 High Sensitivity ELISA Kit(广州艾科思生物科技有限公司)、人白细胞介素13(IL-13) ELISA试剂盒(超敏)(广州徕智生物科技有限公司)。酶标仪(Thermo Fisher Scientific)。

1.3 方法

1.3.1 数据资料收集 收集所有受试者的年龄、性别、大疱性类天疱疮疾病面积指数评分(bullous pemphigoid disease area index, BPDAI)、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分、血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、抗BP180和BP230 IgG抗体表达类型及表达水平等数据。其中荨麻疹样红斑评分来源于BP的BPDAI评分,共120分。使用主观数字评价量表NRS评分,总分为30分。BP抗体谱分为双阳性(抗BP180和BP230抗体均为阳性)和单阳性(抗BP180抗体为阳性、抗BP230抗体为阴性)。

1.3.2 样本收集 分别抽取受试者外周静脉血和局部水疱液,健康受试者通过负压吸疱技术在正常皮肤上取疱液。采用ELISA试剂盒检测血清、疱液样本中IL-4、IL-13细胞因子水平。

1.4 统计学处理

采用 IBM SPSS Statistic 25.0和GraphPad Prism 8.0.1 进行统计学数据分析,IL-4、IL-13水平、血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分等数据满足正态分布,采用均数±标准差表示。两组IL-4、IL-13水平比较,以及不同抗体谱表达下患者血清和疱液中IL-4、IL-13、外周血EOS、血清总IgE水平的比较采用Mann-WhitneyU检验;同一患者血清与疱液组织中IL-4、IL-13水平的相关性分析,患者血清和疱液中IL-4、IL-13水平与其血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒程度评分之间的相关性分析,以及不同抗体谱分类与IL-4、IL-13水平的相关性分析采用Spearman方法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清IL-4、IL-13水平比较

BP组血清(n=42)中的IL-4、IL-13水平分别为(1.88±3.35)、(23.97±29.88) pg/mL;对照组血清(n=24)中的IL-4、IL-13水平分别为(1.13±0.91)、(24.68±27.43) pg/mL,两组IL-4、IL-13水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05,图1A)。

图1 IL-4、IL-13在BP患者及对照组血清、疱液中的表达Figure 1 The levels of IL-4 and IL-13 in the serum and the blister fluid of bullous pemphigoid of the patients and controls.

2.2 两组疱液IL-4、IL-13水平比较

BP组疱液(n=19)中的IL-4、IL-13水平分别为(20.89±14.28)、(282.04±269.93) pg/mL;对照组疱液(n=9)中的IL-4、IL-13水平分别为(7.19±9.79)、(65.43±45.46) pg/mL,BP组明显高于对照组,差异有统计学意义(均P<0.01,图1B)。

2.3 BP患者IL-4、IL-13在血清与在疱液样本中表达水平的相关性

分析12例患者血清及疱液组织中的IL-4、IL-13水平,IL-4在患者血清中的水平为(2.79±5.93) pg/mL,在疱液中的水平为(19.92±12.98) pg/mL,两者无相关性(P=0.430);IL-13在血清中的水平为(21.97±20.25) pg/mL,在疱液中的水平为(333.95±299.03) pg/mL,两者亦无相关性(P=0.347,图2)。

图2 BP患者IL-4、IL-13在血清与在疱液样本中表达水平的相关性Figure 2 The correlation of the serum levels of IL-4 and IL-13 with that of the blister fluid in BP patients.

2.4 患者血清、疱液中IL-4、IL-13水平与血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒程度评分之间的相关性

分析42例患者血清中IL-4、IL-13水平,结果显示, IL-4水平为(1.88±3.35) pg/mL,IL-13水平为(23.97±29.88) pg/mL,两者与血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分均无明显相关性(均P>0.05,表1)。

表1 患者血清、疱液中IL-4、IL-13水平与血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分的相关性分析Table 1 The correlations of IL-4 and IL-13 levels in the serum and blister fluid with total serum IgE levels, eosinophils,erythema score and NRS in BP patients

分析19例患者疱液中IL-4、IL-13水平,结果显示, IL-4水平为(20.89±14.28) pg/mL、IL-13水平为(282.04±269.93) pg/mL,IL-4水平与血清IgE水平呈正相关(r=0.98,P=0.021),而IL-13水平与血清IgE水平,两者与外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分均无明显相关性(均P>0.05,表1)。

2.5 不同抗体谱表达下患者血清中IL-4、IL-13水平差异及二者相关性

分析42例BP患者的血清样本,其中抗体谱双阳性10例, IL-4水平为(1.31±1.31) pg/mL,IL-13水平为(9.96±8.22) pg/mL;抗体谱单阳性32例,IL-4水平为(2.11±3.82) pg/mL,IL-13水平为(27.76±33.20) pg/mL。不同抗体谱分类与患者血清中IL-4水平(P=0.377)、IL-13水平(P=0.223)无明显相关性,不同抗体谱表达下患者血清中的IL-4水平(P=0.370)以及IL-13水平(P=0.219)均无明显差异(图3)。

图3 不同抗体谱表达类型下BP患者血清中IL-4、IL-13细胞因子的表达水平Figure 3 The serum IL-4 and IL-13 levels under different expression status of BP antibodies.

2.6 不同抗体谱表达下患者疱液中IL-4、IL-13水平差异及二者相关性

分析19例BP患者的疱液样本,其中抗体谱双阳性6例,IL-4水平为(19.68±18.18) pg/mL,IL-13水平为(118.26±109.99) pg/mL;抗体谱单阳性13例,IL-4水平为(21.45±12.93) pg/mL,IL-13水平为(357.63±290.95) pg/mL。不同抗体谱分类与患者疱液中IL-4水平无明显相关性(P=0.554),但单阳性抗体谱的表达与疱液中IL-13水平呈正相关(r=0.58,P=0.009);抗体谱单阳性患者疱液中IL-4表达水平与抗体谱双阳性患者比较无统计学差异(P=0.810),而IL-13表达水平明显高于抗体谱双阳性患者,差异有统计学意义(P=0.014,图4)。

图4 不同抗体谱表达类型下BP患者疱液中IL-4、IL-13的表达水平Figure 4 The levels of IL-4 and IL-13 in the blister fluid under different expression status of BP antibodies.

2.7 不同抗体谱表达与外周血EOS、血清总IgE水平的相关性

分析BP患者的血清样本,10例抗体谱双阳性患者的血清样本中外周血嗜酸性粒细胞水平为0.94±1.81(×109/L),血清总IgE水平为(1 516.96±932.08) IU/mL;32例抗体谱单阳性患者的血清样本中外周血嗜酸性粒细胞水平为1.27±2.41(×109/L),血清总IgE水平为(1 288.45±1 567.37)IU/mL。患者血清抗BP180、BP230 IgG抗体的单阳性和双阳性分类与患者外周血嗜酸性粒细胞表达水平(r=0.01,P=0.937)、血清总IgE表达水平(r=-0.24,P=0.141)无明显相关性。

3 讨论

BP是较常见的表皮下自身免疫性水疱性疾病,好发于老年人,常因伴随多种老年合并症、长期使用糖皮质激素引起的并发症以及多脏器功能衰竭而死亡[11-12]。其发病机制较为复杂,可能与人类白细胞抗原(HLA)基因、共病、衰老和触发因素等致病因素之间的相互作用有关[13]。近些年来,随着对BP研究的不断深入和探索,发现BP存在2型炎症表现[14],不仅从临床观察中看到荨麻疹样红斑及剧烈瘙痒等相关症状体征,还有实验室指标的一些提示,如外周血嗜酸性粒细胞、血清总IgE水平的上升等,提示BP与2型炎症密切相关。

Th2细胞及2型细胞因子是2型炎症反应的核心驱动因素,Th2细胞主要分泌IL-5、IL-4和IL-13,其中IL-4已被证明是Th2细胞应答启动的关键细胞因子,而IL-13则在维持Th2细胞应答中发挥更大的作用,二者都参与IgM类转换驱动IgE合成,同时对于Th2细胞的长期维持以及关键Th2细胞因子和趋化因子的持续合成至关重要[15-18]。本研究发现, BP患者血清中IL-4、IL-13表达水平与健康人相比均无明显差异,而患者疱液中IL-4、IL-13表达水平均较健康人显著升高(P<0.01),并且同一患者的血清和疱液组织中IL-4、IL-13表达水平无明显相关性,说明IL-4、IL-13细胞因子在BP皮肤局部富集,提示BP存在局部2型炎症。这也与日本的一项多参数流式细胞术研究结果[9]相符,该研究检测了BP患者外周血和皮肤水疱中能产生IL-2、IL-4、IL-10和IL-13等细胞因子的T细胞,发现患者皮肤水疱中产生IL-13和IL-4的细胞频率明显高于外周血,并且检测到其皮肤归巢受体(皮肤淋巴细胞相关抗原)的相关表达,证明了BP是一种独特的器官特异性的自身免疫病,其特征是皮肤归巢生成IL-13的细胞增多。

T细胞在人体内发挥生物学作用包括再循环和归巢两个过程。淋巴细胞再循环和组织特异性归巢是其发挥各种生物学功能的基础[19]。归巢与不同解剖分区的免疫力密切相关,尤其是皮肤等屏障组织,而归巢至皮肤的CLA+T淋巴细胞便可参与各种皮肤不良免疫反应的发展,从而导致各种过敏性、炎症性等皮肤疾病[20-22]。如特应性皮炎患者的外周血中CLA+T细胞在体内活化后可释放以IL-13为主的2型炎症因子,同时能诱导B 细胞产生IgE;在关节炎型银屑病患者中,CLA+T细胞主要迁移至皮肤而不是关节,进一步证明器官特异归巢受体影响T细胞的分布;在皮肤T细胞淋巴瘤、白癜风等皮肤病中亦可检测到CLA的高表达[19]。较多皮肤疾病的模型及相关研究均指出T细胞归巢皮肤后的致病作用,由此推测BP的局部2型炎症表现亦可归因于T细胞皮肤归巢的机制。

表真皮基底膜带中IgE沉积的BP患者具有显著的荨麻疹丘疹和斑块表现[23]。IgE 自身抗体可能通过激活 IL-4 /13 炎症通路介导 Th1和Th2之间的平衡向2型炎症偏移[24]。目前抗IgE靶向生物制剂奥马珠单抗已被用于难治性病例或免疫抑制治疗禁忌症患者的辅助治疗[25]。本研究发现BP患者血清中IL-4、IL-13水平与血清总IgE水平、外周血嗜酸性粒细胞水平、荨麻疹样红斑评分、瘙痒评分均无明显相关性,而患者疱液中IL-4水平与血清IgE水平呈正相关,研究结果一方面支持了BP存在局部2型炎症的结论,另一方面表明抗IgE自身抗体在BP发病机制中的重要性,同时提示血清总IgE水平或可反映局部2型炎症反应的严重程度,对患者病情的判断及其临床治疗有一定的指导意义。

目前主要研究认为,BP180和BP230免疫复合物诱发了炎症级联反应,导致真表皮交界处炎症细胞招募和促炎分子释放,最终实现表皮与真皮的分离[26-27]。BP患者的BP抗体谱表达主要可分为三大类：抗BP180和抗BP230抗体双阳性、抗BP180或抗BP230抗体单阳性、抗BP180和抗BP230抗体双阴性(目前已经发现p200等其他非BP180、BP230的抗原)[28]。目前尚无研究或报道具体阐述不同抗体谱对BP疾病表型的影响,因此本研究尝试对BP抗体谱进行分层探究,结果发现BP患者血清抗BP180、230抗体谱单阳性的表达与疱液中IL-13细胞因子表达水平呈正相关(r=0.58),血清单阳性抗体表达下疱液中IL-13细胞因子表达水平更高,提示BP180免疫复合物可能通过局部IL-13细胞因子的募集影响2型炎症反应的发生过程,或可有助于未来通过血清抗体谱进行分层精准靶向治疗。未来需扩大样本量进一步研究以减少偏倚及误差,以及开展实验探究抗BP180、BP230 IgG抗体的不同表达类型影响IL-4、IL-13局部表达水平的机制通路。尤其是局部IL-13与抗体分类存在相关性,而IL-4却未显示出明显相关性,其机制仍需进一步探究。

综上所述,本研究探索BP的2型炎症表达过程,进一步证明了IL-4、IL-13在BP皮损中局部富集,IL-4、IL-13和IgE均参与了BP的发病过程,同时血清总IgE水平或可反映局部2型炎症反应的严重程度,对病情评估及治疗有一定的指导意义。BP抗体谱的不同表达则可能成为未来分层治疗的靶点,需有待进一步研究。