HPLC-ELSD同时测定腺梗豨莶草中6个二萜成分的含量

殷 玥,张 璇,呼小娜

(1.长春医学高等专科学校药品食品学院,吉林 长春 130000 ; 2.辽宁天安生物制药股份有限公司,辽宁 沈阳 110000 ;3.东北制药集团股份有限公司,辽宁 沈阳 110000)

《中华人民共和国药典》(2020年版)收载豨莶草为菊科植物豨莶(SiegesbeckiaorientalisL.)、腺梗豨莶(SiegesbeckiapubescensMakino)或毛梗豨莶(SiegesbeckiaglabrescensMakino)的干燥地上部分。腺梗豨莶为豨莶草的药典基原之一,具有祛风湿、利关节和解毒的功效,主治风湿痹痛、四肢麻痹、半身不遂和风疹湿疮等症[1]。腺梗豨莶草广泛分布于吉林、辽宁、河北、甘肃和湖北等多个省份[2],其中主要含有以对映海松烯型和对映贝壳杉烷型为主的二萜类、倍半萜类和黄酮类等成分[3]。现代药理学研究表明,腺梗豨莶草主要有抗炎镇痛、抗血栓、保护心血管和调节免疫系统等功能[4-5]。二萜类化合物是腺梗豨莶草的主要成分且具有广泛的药理活性,因此常作为腺梗豨莶草质量控制的指标成分。《中华人民共和国药典》(2020年版)中豨莶草的含量测定项仅采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)测定奇任醇的含量。苏璇等[6]、刘赞等[7]和闫东旭等[8]建立了HPLC测定豨莶草药材中奇任醇或豨莶精醇的含量。Jiang 等[9]建立了高效液相色谱-飞行时间质谱联用法(High performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry,HPLC-TOF/MS)测定豨莶草中二萜类和黄酮类组分的含量。由于腺梗豨莶草中对映海松烯型二萜类紫外吸收很弱,对映贝壳杉烷型二萜类甚至无紫外吸收,因此不能用高效液相色谱法-紫外检测器同时测定这些类型的二萜类成分。HPLC-TOF/MS虽具有很高的灵敏度和选择性,但检测成本较高,不适用于日常分析工作。目前,有关腺梗豨莶草质量控制方面的研究报道较少,且单一成分的含量测定并不能全面控制其质量,分析方法亟待完善。因此,有必要建立一种可同时检测腺梗豨莶草中多种有效成分含量的分析方法。

本试验建立了高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(High performance liquid chromatography - evaporative light scattering detector,HPLC-ELSD)同时测定腺梗豨莶草6个主要二萜成分(奇任醇、Hythiemoside B、豨莶精醇、对映-17,18-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸和对映-16α氢-贝壳杉烷-17,19-二羧酸)的含量。6个二萜成分的化学结构式如图1所示。

图1 腺梗豨莶草中6个二萜成分的化学结构式Fig.1 Chemical structural formulas of the six diterpenoids in Siegesbeckia pubescens MakinoA～C:对映海松烯型二萜; D～F:对映贝壳杉烷型二萜A-C:ent-pimarane; D-F:ent-kaurane

1 材料与方法

1.1 主要药品和试剂 奇任醇、Hythiemoside B、豨莶精醇、对映-17,18-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸和对映-16α氢-贝壳杉烷-17,19-二羧酸精制品(纯度均>98.0%),均为本实验室自制;本试验所用2个批次的腺梗豨莶草药材(批号1和2),均购自河北省安国振宇中药饮片有限公司,经沈阳药科大学殷军教授鉴定为菊科豨莶属植物腺梗豨莶的干燥全草;甲醇、乙酸乙酯、乙醇(分析纯)、甲酸和乙腈(色谱纯),均购自天津康科德科技有限公司。

1.2 主要仪器 Jasco PU-2080 plus Pump(日本分光公司),ELSD 2000ES 蒸发光散射检测器(美国Alltech公司),Sepu 3000 工作站(浙江大学),BS110S型电子天平(德国Sartorius公司),AB135-S十万分之一天平(METTLER TOLEDO仪器有限公司)。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照溶液的制备 对照储备液:精密称取奇任醇、Hythiemoside B、豨莶精醇、对映-17,18-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸和对映-16α氢-贝壳杉烷-17,19-二羧酸精制品,分别加甲醇溶解制成浓度为1 mg/mL的对照储备液。

混合对照储备液:精密量取上述6个对照储备液,置于 25 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成奇任醇、Hythiemoside B、豨莶精醇、对映-17,18-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸和对映-16α氢-贝壳杉烷-17,19-二羧酸浓度分别为500、150、50、150、350和300 μg/mL的混合对照储备液。

1.3.2 供试品溶液的制备 分别收集腺梗豨莶草药材的叶、枝和茎,粉碎(过380 μm筛)。精密称定不同部位干燥粉末40 g,分别加10倍量甲醇回流提取1次,再加10倍量乙酸乙酯回流提取2次,每次1 h,合并提取液,过滤,滤液经旋转蒸发仪于45 ℃水浴减压除去溶剂,残渣用甲醇转移至20 mL量瓶中,用甲醇溶解,定容并摇匀,即得腺梗豨莶草叶、枝和茎溶液。精密量取叶和枝溶液各5 mL,分别置于50 mL和10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,混匀,过0.45 μm滤膜,取续滤液,供高效液相色谱仪分析。

1.4 检测方法

1.4.1 色谱条件 流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;蒸发光散射检测器漂移管温度:103 ℃;雾化气流速:3.0 L/min;进样量:20 μL;色谱柱:Symmetry ShieldTMRP18 色谱柱 (250 mm × 4.6 mm,5 μm,Waters);流动相:A相为0.3%甲酸水溶液,B相为乙腈;梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.4.2 标准曲线和线性关系考察 分别精密量取混合对照储备液1、2、4、6、8和10 mL至10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得混合对照溶液。在“1.4.1”项色谱条件下进样分析。以各对照品峰面积的对数值(y)为纵坐标,质量浓度的对数值(x)为横坐标,进行回归计算。

1.4.3 系统适用性试验 取“1.4.2”项混合对照溶液在“1.4.1”项色谱条件下进样分析,记录混合对照品色谱图。

1.4.4 精密度试验 取同一混合对照溶液在“1.4.1”项色谱条件下,重复进样6次,测定峰面积,并计算6个二萜类化合物峰面积的相对标准偏差(Relative standard deviaton,RSD)。

1.4.5 重复性试验 精密称取同一批腺梗豨莶草药材枝部位粉末(过380 μm筛),按“1.3.2”项方法平行制备供试品溶液6份,在“1.4.1”项色谱条件下进样分析,计算6个二萜类化合物含量的RSD。同法在连续3 d内进行样品测定,考察方法的日间精密度。

1.4.6 加样回收率试验 精密称定9 份批号1的腺梗豨莶草药材枝部位粉末(过380 μm筛),每份约20 g。分别加入一定量的奇任醇、Hythiemoside B、豨莶精醇、对映-17,18-三羟基-贝壳杉烷-19-羧酸、对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸和对映-16α氢-贝壳杉烷-17,19-二羧酸共6个二萜对照储备液(约相当于 20 g 药材中所含各化合物的量),按“1.3.2”项方法分别制备低、中、高3个质量浓度的供试品溶液,在“1.4.1”项色谱条件下进样分析,根据公式(1)计算回收率并计算RSD值。

回收率(%)=测得量÷加入量×100%

(1)

1.4.7 稳定性试验 取同一份腺梗豨莶草药材枝部位供试品溶液,室温放置,分别于0、12、24、48和72 h后,在“1.4.1”项色谱条件下进样分析,测定峰面积,并计算 6 个二萜类化合物峰面积的RSD。

1.4.8 样品含量测定 取批号1和2的腺梗豨莶草药材,按“1.3.2”项方法制备供试品溶液,在“1.4.1”项色谱条件下进样分析,记录色谱图,按外标两点法计算样品中 6 个二萜类化合物的含量。

2 结果

2.1 标准曲线和线性关系考察 结果如表2所示,6个二萜类化合物在各自的线性范围内线性关系良好(r≥0.999 2)。

表2 腺梗豨莶草中6个二萜类化合物的线性回归方程、相关系数和线性范围Table 2 Regression equation,correlation coefficient (r) and linearity range for the six diterpenoids in Siegesbeckia pubescens Makino

2.2 系统适用性试验 如图2A所示,混合对照品中6个二萜类化合物分离度良好,与相邻色谱峰的分离度均大于1.5,各色谱峰的理论塔板数均不低于4 000。

图2 混合对照品(A)和腺梗豨莶草叶(B)、枝(C)、茎(D)样品提取物的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the standard mixture (A)and the leaves (B),branches (C),stems(D) of Siegesbeckia pubescens Makino

2.3 精密度试验 同一混合对照溶液重复测定6次,6个二萜类化合物峰面积的RSD为0.54%～1.1%,表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验 平行制备的6份供试品溶液中6个二萜类化合物含量的RSD为1.0%～2.9%,连续3 d测定的6个二萜类化合物含量的RSD为1.5%～3.5%,表明该方法重复性良好。

2.5 加样回收率试验 如表3所示,低、中、高 3个质量浓度的供试品溶液中6个二萜类化合物含量的回收率介于96.5%～101.5%,RSD均小于2.3%,表明该方法具有良好的回收率和精密度,符合分析要求。

表3 腺梗豨莶草中6个二萜类化合物的加样回收率试验Table 3 Recoveries of the six diterpenoids in Siegesbeckia pubescens Makino (n=3)

2.6 稳定性试验 腺梗豨莶草药材枝部位供试品溶液于室温放置0、12、24、48和72 h后,6 个二萜类化合物峰面积的 RSD值均小于 3.3%,表明供试品溶液于室温放置 72 h内稳定。

2.7 样品含量测定 腺梗豨莶草叶、枝、茎样品提取物的液相色谱图见图2B～2D。对2个批次的药材样品中6个二萜类化合物的含量进行测定,结果如表4所示,叶中均未检测到Hythiemmoside B,茎中均未检测到豨莶精醇,枝中虽然检测出6个二萜类化合物,但含量低于叶中含量。结果表明,采用HPLC-ELSD测定腺梗豨莶草叶、枝、茎中6个二萜类化合物的含量,方法简便、准确,且腺梗豨莶草不同部位(叶、枝、茎)的二萜成分含量差异较大。

表4 腺梗豨莶草不同部位的6个二萜类化合物的成分分析Table 4 Compound analysis of the six diterpenoids in different parts of Siegesbeckia pubescens Makino (mg/g,n=3)

3 讨论

3.1 提取方法考察 前期试验采用单因素循环法,分别考察了提取时间(0.5、1.0和1.5 h)、提取次数(1、2和3次)、提取方式(超声和回流)、提取溶剂(甲醇、80%乙醇、无水乙醇和乙酸乙酯)以及溶剂倍量(8、10和12倍)对提取效率的影响。由于6个二萜类化合物极性差别较大,最终选择的提取方法为:10倍量甲醇回流提取1次,10倍量乙酸乙酯回流提取2次(每次1 h)。采用该提取方法使药材中总二萜成分的提取效率最高,且目标分析物的干扰最小。

3.2 色谱条件考察 流动相的选择对色谱峰分离度、峰形和化合物的离子化程度有重要影响。本试验考察了甲醇-水和乙腈-水体系作为流动相,由于乙腈的洗脱能力强于甲醇,有助于在较短时间内完成分析且峰形较好,因此选择乙腈-水体系作为流动相。由于部分化合物中含有羧基,在进一步优化色谱条件的过程中考察了加入甲酸、冰醋酸和乙酸铵对化合物色谱行为的影响。结果显示,采用0.3%甲酸水溶液-乙腈为流动相时色谱峰的峰形和分离度较好,因此选择0.3%甲酸水溶液-乙腈为流动相。

3.3 蒸发光散射检测器(Evaporative light scattering detector,ELSD)参数考察 ELSD的检测原理是首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶,然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发,在光散射检测池中检测剩余的不挥发性溶质颗粒[10]。本试验考察了ELSD的3个重要参数:撞击器操作模式、漂移管温度和雾化气流速,以使信噪比达到最大。ELSD 2000ES 有2种不同的撞击器操作模式:开和关。在撞击器处于关的模式下,气溶胶不分流,全部样品流都到达光散射检测池以获得最佳灵敏度,该操作模式适用于分析非挥发性样品;在撞击器处于开的模式下,大的液滴从废液管排出,余下的液滴则通过漂移管到达光散射检测池,该操作模式适用于分析半挥发性样品或使用高流速流动相时分析样品。由于6个二萜类化合物为非挥发性化合物,因此选择撞击器关的操作模式。漂移管温度和雾化气流速的考察范围分别为 90～110 ℃ 和 2.5～3.2 L/min,以信噪比作为选择2个参数的标准。漂移管温度过高可能会导致流动相在漂移管内沸腾,过低则溶剂挥发不完全,2种情况均会使基线噪音增加,信噪比降低。雾化气的流速越高,形成的液滴越小,越容易蒸发,但同时小颗粒散射光少,会导致灵敏度降低;而雾化气流速过低,形成的液滴过大,溶剂蒸发不完全,基线噪音增加。结果表明,当漂移管温度为103 ℃,雾化气流速为3.0 L/min时获得的信噪比最高。

3.4 样品测定结果分析 对2个批次的药材样品的测定结果表明,腺梗豨莶草药材不同部位所含二萜成分含量差别显著。药材叶和茎中含量最高的成分为奇任醇,而枝中含量最高的成分则为对映-16β,17-二羟基-贝壳杉烷-19-羧酸。只有药材的枝中能检测到所有6个二萜成分,叶中未检测到Hythiemoside B,茎中未检测到豨莶精醇。另外,药材叶中对映海松烯型二萜、对映贝壳杉烷型二萜和总二萜的含量远高于药材枝和茎中的含量。以上这些差异与豨莶草药材的质量直接相关。鉴于叶中二萜类化合物活性成分含量最高,因此建议将叶作为最佳入药部位。

综上所述,本试验首次建立了准确灵敏的 HPLC-ELSD同时测定豨莶草药材中的2种类型(对映海松烯型和对映贝壳杉烷型)共6个二萜类化合物的含量。使用该方法成功测定了2批腺梗豨莶草药材不同部位(叶、枝、茎)中二萜类化合物的含量,并比较了不同部位中对映海松烯型二萜、对映贝壳杉烷型二萜和总二萜含量的差异。该方法简单、高效,适合常规分析,为腺梗豨莶草药材全面的质量评价和临床应用中最佳药用部位的选择提供了参考依据。