溴莫尼定联合水合氯醛对大鼠和小鼠的麻醉效果

张 川,王晓辉,吕 楠,陈 斌

(天津市医药科学研究所,天津 和平 300020)

溴莫尼定是高选择性肾上腺素能α2受体激动剂,除了具有降眼压的临床作用外,对小型动物有较好的麻醉和镇痛效果,且对呼吸和心血管功能影响较小[1-2],可以满足多种给药方式,组织吸收性好[3]。然而,溴莫尼定单独应用仍不足以达到完全理想的麻醉要求。

水合氯醛是常用镇静剂,可以激活γ-氨基丁酸A(Gamma-amino butyric acid A,GABAA)受体,有起效快和成本低等优势[4]。但因水合氧醛没有镇痛作用,单独使用不能满足存活动物的外科手术麻醉要求,同时也违背实验动物伦理要求[5]。在外科手术或有疼痛感受的检查操作时,如果使用水合氯醛,需要与其他麻醉或镇痛药物合用。

目前,实验室大鼠和小鼠手术中所用的非气体麻醉药物,因受到管控的影响导致选择受限。常用的麻醉方案多采用α2受体激动剂与其他药物合用,比如:右美托咪定与舒泰联合麻醉,赛拉嗪与水合氯醛联合麻醉,前一方案对大鼠较安全且效果较好[6],但对小鼠的治疗指数狭窄[7]且药物价格昂贵;后一方案对大鼠和小鼠的治疗指数较狭窄,且颉颃剂催醒效果欠佳。

本试验尝试将溴莫尼定与水合氯醛联合使用,通过发挥2种药物的优势,降低药物的使用剂量,在使麻醉效果达到常规手术需求的同时,减少药物对动物机体造成的伤害,同时控制麻醉成本。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物配制

1.1.1 主要试剂 阿替美唑粉剂(批号为20201218)和溴莫尼定粉剂(批号为AG08-PK20200701),均购自深圳市星凯越生物科技有限公司;水合氯醛粉剂(批号为20200324),购自天津科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 药物配制 配制含9 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛联合溶液,用于大鼠高剂量组的麻醉;配制含6 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛联合溶液,用于大鼠低剂量组的麻醉。配制含3.6 mg/mL溴莫尼定的5%水合氯醛联合溶液,用于小鼠高剂量组的麻醉;配制含2.4 mg/mL 溴莫尼定的5%水合氯醛联合溶液,用于小鼠低剂量组的麻醉。配制浓度为0.2 mg/mL的阿替美唑溶液,用于大鼠高剂量麻醉和颉颃剂组的催醒;配制浓度为1 mg/mL的阿替美唑溶液,用于小鼠颉颃剂高剂量组和低剂量组的催醒。

1.2 主要仪器 ALC-NIBP无创血压测量分析系统,购自上海奥尔科特生物科技有限公司;医用电子体温计,购自广州倍尔康医疗器械有限公司。

1.3 实验动物 健康SD大鼠(雄性,SPF级,体重180～200 g)和健康C57小鼠(雄性,SPF级,体重18～20 g),均购自北京维通利华实验动物中心[实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016—0006]。动物试验在天津市医药科学研究所的动物室[使用许可证号:SYXK(津)2021—0005]完成。动物试验经天津市医药科学研究所动物伦理委员会批准,许可编码:IMPS-EAEP-Q-2020-01。试验结束,所有动物麻醉后人道处死。

1.4 试验方法

1.4.1 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射对大鼠的联合麻醉作用 取10只大鼠随机分为高剂量组和低剂量组,每组5只。高剂量组大鼠用含9 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛联合溶液以1 mL/(kg·bw)剂量腹腔注射,给药剂量为9 mg/(kg·bw) 溴莫尼定和100 mg/(kg·bw)水合氯醛;低剂量组大鼠用含6 mg/mL溴莫尼定的10%水合氯醛联合溶液以1 mL/(kg·bw)剂量腹腔注射,给药剂量为6 mg/(kg·bw) 溴莫尼定和100 mg/(kg·bw)水合氯醛。观察大鼠的麻醉反应:(1)大鼠行为和自主活动:外观姿势、精神状态、钳夹四肢和针刺尾尖刺激后反应情况等;(2)麻醉时间:从给药到钳夹和针刺反射消失的时间为麻醉诱导时间,反射消失到反射恢复的时间为麻醉维持时间。在大鼠进入麻醉时,双眼上眼膏,以避免大鼠在麻醉期间因失去眨眼能力导致的角膜伤害。

1.4.2 联合麻醉和颉颃剂对大鼠血压、心率和体温的影响 取10只大鼠随机分为大鼠高剂量麻醉和颉颃剂组及大鼠高剂量组,每组5只。大鼠高剂量麻醉和颉颃剂组按1.4.1中大鼠高剂量组的方案给药。给药前将大鼠尾部固定在ALC-NIBP无创血压测量分析系统的固定附件内,通过振荡法无创测定基础心率和血压。大鼠腹腔注射麻醉后15、30和45 min,测定大鼠心率和血压,记录心血管动力学随时间的变化。在麻醉后45 min时,检测心率和血压后,按0.1 mg/(kg·bw)剂量肌肉注射0.2 mg/mL的阿替美唑溶液,并在麻醉后50 min时再次检测心率和血压。大鼠高剂量组给药方案同1.4.1,观察期内不注射阿替美唑。在22 ℃的室温环境下,分别于麻醉前以及麻醉后15、30、45、60、75、90、105和120 min时,用医用电子体温计测量并记录大鼠的口腔温度,观察大鼠行为活动情况。

1.4.3 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射对小鼠的联合麻醉作用 取10只小鼠随机分为高剂量组和低剂量组,每组5只。高剂量组小鼠用含3.6 mg/mL溴莫尼定的5%水合氯醛联合溶液以5 mL/(kg·bw)剂量腹腔注射,给药剂量为18 mg/(kg·bw)溴莫尼定和250 mg/(kg·bw)水合氯醛;低剂量组小鼠用含2.4 mg/mL溴莫尼定的5%水合氯醛联合溶液以5 mL/(kg·bw)剂量腹腔注射,给药剂量为12 mg/(kg·bw)溴莫尼定和250 mg/(kg·bw)水合氯醛。待小鼠静卧不动时,仰卧位置于保温台上保持体温。观察小鼠的麻醉反应,方法同1.4.1。

1.4.4 颉颃剂对联合麻醉小鼠低体温和尿潴留的预防作用 取10只小鼠随机分为小鼠颉颃剂高剂量组和低剂量组,每组5只。用含2.4 mg/mL溴莫尼定和5%水合氯醛的低剂量麻醉联合溶液以5 mL/(kg·bw)剂量腹腔注射。待小鼠静卧不动时,仰卧位置于保温台上保持体温。麻醉15 min后,用医用电子体温计测量并记录小鼠的口腔温度。小鼠颉颃剂低剂量组按0.8 mg/(kg·bw)剂量肌肉注射1 mg/mL的阿替美唑溶液,小鼠恢复活动后置于室温环境,在给药后5、10、15、20、25、30、60、90和120 min时,用医用电子体温计测量并记录小鼠的口腔温度,观察小鼠行为活动情况。小鼠颉颃剂高剂量组按1.6 mg/(kg·bw)剂量肌肉注射1 mg/mL的阿替美唑溶液,小鼠恢复活动后置于室温环境,同前测量并记录口腔温度。小鼠体温低于32 ℃时停止温度测量,放回保温台。进入苏醒期5 h后,过量麻醉处死小鼠,解剖观察膀胱充盈情况。

1.5 统计分析 用SPSS 17.0软件进行统计学分析,用t检验方法将大鼠高剂量组和低剂量组之间以及小鼠高剂量组和低剂量组之间的麻醉诱导时间和麻醉维持时间进行比较。用方差分析法比较大鼠高剂量组各时间点血压、心率和体温的变化,并用dunnett-t检验将后续各时间结果与给药前的血压和心率进行比较。P<0.05 表示差异显著,P<0.01 表示差异极显著,P<0.001 表示差异极其显著。

2 结果

2.1 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射对大鼠的联合麻醉作用 注射后大鼠先表现躁动,逐渐出现共济失调,随后动作减少,呼吸减慢变深,眼球突出,最后针刺和钳夹反射消失。如图1所示,大鼠高剂量组麻醉维持时间[(27.8±13.3)min]较低剂量组[ (6.2±2.7) min]极显著延长(P<0.01);高剂量组麻醉诱导时间[(4.0±1.4)min]较低剂量组[(11.6±1.8)min]极其显著缩短(P<0.001);麻醉期内所有大鼠都有逐滴排尿现象。

图1 大鼠的麻醉诱导时间和麻醉维持时间Fig.1 Induction time and maintenance time of anesthesia in rats低剂量组与高剂量组相比,**:P<0.01; ***:P<0.001Comparison between Low-dose group and High-dose group,**:P<0.01;***:P<0.001

2.2 联合麻醉和颉颃剂对大鼠的血压、心率和体温的影响 如图2所示,2个组大鼠的血压在麻醉后变化平稳,各个时间点的高压、低压和平均动脉压均没有显著差异(P>0.05)。高剂量麻醉和颉颃剂组在阿替美唑麻醉后(50 min),高压、低压和平均动脉压与麻醉前的各时间点相比,也均没有显著差异(P>0.05)。

图2 大鼠联合麻醉后的血压变化Fig.2 Changes of blood pressure of rats after combined anesthesiaA:高剂量麻醉和颉颃剂组; B:高剂量组A: High-dose anesthesia and reversal group; B: High-dose group

如图3所示,大鼠高剂量组麻醉期间(麻醉后0～50 min)各时间点与麻醉前(0 min)相比,心率呈下降趋势(P<0.05或P<0.01)。高剂量麻醉和颉颃剂组麻醉期间(麻醉后0～45 min)各时间点与麻醉前(0 min)相比,心率呈显著下降趋势。与麻醉前[(373.3±21.6)次/min]相比,麻醉后15 min时大鼠心率[(310.6±34.8)次/min]显著下降(P<0.05),麻醉后30 min时心率[(350.3±5.2)次/min]和45 min时心率[(235.6±2.7)次/min]极显著下降(P<0.01)。但麻醉后30和45 min时,大鼠钳夹和针刺反射恢复。阿替美唑注射5 min后,所有大鼠恢复活动,心率回升到(376.9±22.4)次/min,但此时的心率仍极显著低于麻醉前的心率(P<0.01)。

图3 大鼠联合麻醉后的心率变化Fig.3 Changes of heart rate of rats after combined anesthesia与麻醉前(0 min)相比,高剂量组:*:P<0.05,**:P<0.01;高剂量麻醉和颉颃剂组:#:P<0.05,##:P<0.01Compared with pre-anesthesia(0 min), high-dose group: *: P<0.05, **: P<0.01;high-dose anesthesia and reversal group: #: P<0.05, ##: P<0.01

如图4所示,2个组大鼠麻醉后体温有轻度下降的趋势,与麻醉前体温(38.0±0.4)℃相比,高剂量组在各时间点的体温均无显著性差异(P>0.05)。在高剂量麻醉和颉颃剂组,麻醉前体温(37.8±0.3)℃分别与麻醉后15、30和45 min时的体温,即(37.7±0.4)℃、(37.3±0.5)℃和(37.1±0.6)℃相比,均没有显著性差异(P>0.05),之后大鼠逐渐恢复自主运动,体温保持平稳。单只大鼠的最低温度为35.9 ℃,为高剂量麻醉和颉颃剂组麻醉后75 min的时间点测得。

图4 大鼠联合麻醉后的体温变化Fig.4 Changes of temperature of rats after combined anesthesia

2.3 溴莫尼定和水合氯醛腹腔注射对小鼠的联合麻醉作用 注射后小鼠逐渐出现共济失调,随后动作减少,呼吸减慢变深,眼球突出,最后针刺和钳夹反射消失。如图5所示,小鼠低剂量组麻醉诱导时间为(6.4±1.9)min,麻醉维持时间为(9.4±2.7)min,高剂量组麻醉诱导时间为(5.4±1.1)min,麻醉维持时间为(12.4±2.9)min,两组差异不显著(P>0.05)。麻醉期内小鼠没有排尿现象。

图5 小鼠的麻醉诱导时间和麻醉维持时间Fig.5 Induction time and maintenance time of anesthesia in mice

2.4 颉颃剂对联合麻醉小鼠低体温和尿潴留的预防作用 颉颃剂高剂量组和低剂量组小鼠肌肉注射阿替美唑后,所有小鼠均于2 min内起身,多数小鼠在起身前十几秒大量排尿。小鼠可自主活动,但有明显的共济失调表现。

颉颃剂低剂量组小鼠脱离温箱保温环境后,体温在20 min内降至32 ℃以下,低于测量仪器的测温最低值,随着体温降低,小鼠的行动逐渐减少、静卧,但碰触后仍可活动,皮肤发冷明显;5 h后部分小鼠体温回升到32 ℃以上,并恢复自主活动。颉颃剂高剂量组小鼠脱离温箱保温环境后,体温在30 min内有所下降,最低体温为33.2 ℃(2号小鼠,25 min),所有小鼠仍能自主活动,90 min后体温恢复到脱离温箱之前的水平(图6)。

图6 阿替美唑给药后麻醉小鼠的体温变化Fig.6 Changes of the temperature of anesthetized mice which were injected intramuscularly with atipamezole

小鼠恢复活动5 h后,解剖观察发现,颉颃剂低剂量组有1只小鼠膀胱明显充盈,组内其余小鼠和颉颃剂高剂量组小鼠膀胱充盈均不明显。

3 讨论

麻醉剂量的水合氯醛易使大鼠发生室性心动过速[8]、肠动力抑制和肠粘连[9],溴莫尼定与水合氯醛联合麻醉小型动物时,在中枢有协同镇静作用,很大程度降低了水合氯醛的用量,并降低其副作用,弥补了单用水合氯醛和镇痛作用的不足[10]。研究表明,将赛拉嗪[10 mg/(kg·bw),腹腔注射]与水合氯醛[150 mg/(kg·bw),腹腔注射]合用,可导致大鼠翻正反射消失,麻醉诱导时间1.5 min,麻醉维持时间1.5 h,但大鼠翻正反射消失并不足以证明药物组合可达到外科麻醉的深度,需要钳夹反射的消失和恢复作为观察指标[11]。另有研究将赛拉嗪[12]或赛拉唑[13]与水合氯醛合用麻醉家兔,但因赛拉嗪和赛拉唑本身的安全范围不大,导致这些联合麻醉方案有一定危险性,容易麻醉过量[14-15]。Chen等[1]研究表明,0.4 mg/(kg·bw)和0.5 mg/(kg·bw)的溴莫尼定分别对小鼠和大鼠有较好的镇痛作用,0.6 mg/(kg·bw)溴莫尼定和30 mg/(kg·bw)水合氯醛联合麻醉对家兔具有较好的麻醉效果,安全范围广,不良反应轻。这提示溴莫尼定与水合氯醛的组合也可以用于大鼠和小鼠的联合麻醉。

本试验中,溴莫尼定与水合氯醛联合腹腔注射,所有大鼠和小鼠都观察到钳夹和针刺反射消失,表明溴莫尼定与水合氯醛联合使用具有较稳定的麻醉效果。9 mg/(kg·bw)溴莫尼定与100 mg/(kg·bw)水合氯醛联合麻醉对大鼠的麻醉维持时间,以及12 mg/(kg·bw)溴莫尼定与250 mg/(kg·bw)水合氯醛联合麻醉对小鼠的麻醉维持时间均可满足简单手术所需,麻醉深度较好,无动物死亡。

本试验观察到麻醉过程中大鼠血压保持稳定,但心率下降,其原因可能是联合麻醉使动物交感压力降低,调高了动脉压力感受反射敏感性,使不高的血压也能反射性降低心率[16]。α2受体激动剂单独使用能调高动脉压力感受反射敏感性[17],而水合氯醛单独使用则降低反射敏感性[18]。

本试验结果显示,阿替美唑可使麻醉大鼠和小鼠快速苏醒且心率回升。阿替美唑能有效且迅速颉颃溴莫尼定与水合氯醛的麻醉作用,与之相比,苯噁唑颉颃赛拉嗪和水合氯醛联合麻醉的方案则有催醒作用不佳的缺点[19]。苯噁唑是α2受体颉颃剂,且有一定的α1受体颉颃活性,适合用于α2/α1中等选择性的赛拉嗪镇静剂的颉颃剂[20]。Yarbrough 等[19]研究发现,中等选择性的α2受体颉颃剂苯噁唑对10 mg/(kg·bw)赛拉嗪和250 mg/(kg·bw)水合氯醛联合麻醉小鼠的催醒剂量区间很窄,因为如果使用剂量稍高,颉颃剂的α1受体颉颃活性可以和水合氯醛再次产生协同镇静作用,动物则不会被催醒。阿替美唑是高选择性α2受体颉颃剂,α1受体颉颃活性极低[21],对高选择性α2受体激动剂和水合氯醛联合麻醉的小动物使用较高剂量时,不会产生类似苯噁唑的再次镇静作用。

本试验观察到在麻醉时大鼠都有逐滴排尿的现象,小鼠在麻醉过程中不排尿,不用颉颃剂的全部小鼠和使用低剂量颉颃剂的少数小鼠在麻醉后可见膀胱充盈明显。这可能是溴莫尼定作用于下丘脑室旁核α2受体,抑制抗利尿激素的释放,导致尿量增多,同时麻醉过程中溴莫尼定抑制去甲肾上腺素的释放,抑制膀胱的收缩[22],这是大鼠多尿且逐滴排尿,小鼠解剖发现膀胱充盈的原因。镇静剂右美托咪定也有类似的作用[23-24]。Wells 等[25]研究发现,0.5 mg/(kg·bw)右美托咪定给药后,有3%的雄性小鼠在24～72 h内出现了严重的尿道阻塞,甚至死亡。肌肉注射0.1 mg/(kg·bw)阿替美唑的大鼠和肌肉注射1.6 mg/(kg·bw)阿替美唑的小鼠因颉颃剂的作用,膀胱收缩恢复,在苏醒前大量排出存尿,有效避免了尿潴留。

小鼠麻醉状态下保持体温的能力较弱,容易因明显的体温过低造成损伤[26],故要求小鼠在麻醉操作中需要做好保温。联合麻醉后的小鼠肌肉注射较高剂量[1.6 mg/(kg·bw)]的阿替美唑,在快速催醒、有效防止尿潴留的同时,还可预防体温过低。在室温下,大鼠联合麻醉体温虽有轻度下降,但总体稳定,对麻醉过程影响不大,没有出现体温过低情况,不需要专门保温措施。

本试验中还发现,大鼠和小鼠在麻醉过程中眼球明显外凸,苏醒时眼球缩回正常位置。溴莫尼定对人有缩小瞳孔和降低眼压的作用,但对大鼠和小鼠的影响有物种差异性,使用溴莫尼定后反而会表现为扩瞳[27],可能由此引起大鼠和小鼠眼压增高,使眼球外凸。

综上所述,溴莫尼定与水合氯醛联合麻醉具有效果稳定、操作方便、性价比高和心血管动力学影响较小等优点,是一种可行的小动物手术麻醉方案,也可为溴莫尼定与其他拟GABA镇静剂的合用提供参考和指导,阿替美唑作为其颉颃剂进一步增加了这种麻醉方案的安全性。