日粮精粗比对舍饲育肥牦牛瘤胃菌群结构、挥发性脂肪酸及其转运载体表达量的影响

徐俊杰,王莹,丁宁,马向花,刘塔,周天赐,李涛,袁朝海,张威,蔡亚非*

(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.江苏省奶牛生产性能测定中心,江苏 南京 210095;3.广州海关技术中心,广东 广州 510623;4.青海省海南州科技局,青海 海南813000)

牦牛作为多经济用途的高原特种牛种,其养殖业是青海省的特色优势产业。舍饲育肥是青海省在牦牛产业化养殖发展大环境下进行积极探索总结的技术。牛的瘤胃代谢对维持机体正常运转至关重要。作为与宿主互利共生的瘤胃微生物,它们帮助宿主消化降解粗纤维饲料、蛋白饲料、能量饲料和脂肪饲料,并为机体提供营养物质[1-2]。在反刍动物瘤胃中,各菌群之间相互依存又相互制约,维持瘤胃内环境的稳态。动物品种、年龄、性别、日粮结构和健康状况等都可影响动物瘤胃发酵状况,其中日粮结构作为稳定可控的因素一直是研究热点之一。研究表明,反刍动物瘤胃微生物菌群结构和瘤胃发酵类型受日粮结构因素调节,合适的日粮精粗(质量)比可改善动物机体瘤胃代谢水平,提高生产性能[3]。但由于牦牛特殊的日粮结构组成,目前舍饲育肥牦牛尚无专门化日粮饲喂体系。同时,舍饲条件下如何提高育肥牦牛日粮能量利用效率和优化瘤胃发酵的机制尚不明确。近年来调控日粮结构对舍饲育肥牦牛瘤胃代谢影响的相关研究较少,所以,本试验给舍饲育肥牦牛饲喂精粗比(质量比)为3∶7、5∶5、7∶3的全混合日粮,通过测定瘤胃液细菌菌群结构、瘤胃液VFA含量、瘤胃上皮细胞中VFA转运载体表达量以及生产性能,探究适合舍饲育肥牦牛饲喂的日粮结构组成。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物试验在青海省海南藏族自治州共和县下梅村兴隆牦牛养殖合作社(E100.62°,N36.28°,平均海拔3 200 m)进行。预饲期为7 d,正式饲喂时间为90 d。试验选取15 头健康阉牦牛,年龄2～3 岁,平均体重约130.4 kg。

1.1.2 饲养管理将牦牛分为A、B、C 3组,日粮精粗(质量)比分别为3∶7、5∶5、7∶3,每组5 头,每个试验组牦牛饲养在不同的单独圈舍,自由饮水。依据预饲期牦牛采食规律,每日上午10：00饲喂1次,按照每头牛平均5 kg日粮进行饲喂,次日早上收集剩余料。

1.1.3 试验日粮精料组成参照青海省地方标准《出栏牦牛适度补饲技术：DB 63/T 1787—2020》中“出栏牦牛适度补饲精料配方及养分含量”。精料组成及营养水平见表1。粗料组成：短芒老麦芒、玉米秸秆和苜蓿草按 1∶1∶1(质量比)配制。

表1 精饲料组成及营养水平Table 1 Composition and nutritional level of concentrate

1.2 样品采集

正式试验结束,将试验牦牛禁食12 h后进行屠宰。瘤胃液采集：取出瘤胃切口,持灭菌的一次性10 mL注射器吸取瘤胃液若干,置于10 mL灭菌离心管中,迅速放入液氮冻存,转移至-80 ℃冰箱保存备用。瘤胃液细菌菌群结构测定;将10 mL离心管中瘤胃液4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min,将上清液分装转移至新的5 mL离心管中,-80 ℃保存,用于测定瘤胃发酵参数。

瘤胃上皮组织采集：打开瘤胃,剪取瘤胃上皮(背囊、腹囊、背盲囊和腹盲囊)若干,用1×PBS将组织冲洗干净,撕去肌肉层,将瘤胃上皮修剪为大约4 cm2块状并放入2 mL冻存管中,立即置于液氮中速冻,保存在-80 ℃冰箱中,用于RNA和蛋白提取。

1.3 试剂与方法

1.3.1 瘤胃菌群测定细菌DNA的提取参照D4015粪便DNA提取试剂盒(D4015 Stool DNA Kit)进行。采用ABI GeneAmp®9700 型PCR仪进行PCR试验。设计16S v3-v4区特定引物扩增特异区域,引物名称341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′/806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR 采用 2×Phanta Master Mix,30 μL 反应体系：2×Phanta Master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1)1 μL、Primer R(10 μmol·L-1)1 μL、Genomic DNA 10～20 ng,补 ddH2O 至 30 μL。PCR 反应参数：95 ℃预变性5 min;27个循环：95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s;熔解曲线：72 ℃ 10 s,10 ℃ ∞。电泳验证并进行引入 Illumina 桥式 PCR 兼容引物的扩增。扩增结束后对产物进行琼脂糖电泳检测。检测参数：胶浓度 20 g·L-1、电压80 V、电泳时间40 min。剪切并回收目的条带,使用Thermo Scientific公司GeneJET胶回收试剂盒回收纯化产物。样品的 16S rDNA 检测由南京集思慧远生物科技有限公司完成。

1.3.2 瘤胃发酵参数测定瘤胃pH值测定：取出舍饲育肥牦牛瘤胃液,纱布过滤后收集到5 mL试管中,用pH计(赛多利斯,型号：PB-10)测定。取出低温保存的瘤胃液样品,放到4 ℃冰箱缓慢解冻,解冻后 8 000 r·min-1离心10 min。量取10 mL瘤胃液上清液,倒入离心管中,加入3 mL体积比为1∶1的25%偏磷酸去蛋白溶液和0.6% 2-乙基丁酸混合液,放入-20 ℃冰箱中,以备VFA含量测定。VFA含量参照曹庆云等[4]的方法测定,气相色谱仪使用岛津GC-2014。

1.3.3 瘤胃上皮VFA转运载体基因表达量测定利用Trizol裂解组织、氯仿分相、异丙醇沉淀、乙醇洗涤,得到纯净的总RNA。采用TaKaRa反转录试剂盒进行cDNA的合成,所得cDNA保存于-20 ℃冰箱。RT-qPCR引物均购自上海生工生物工程有限公司,引物序列见表2。利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix检测挥发性脂肪酸转运载体基因mRNA的表达水平,反应产物经熔解曲线检测特异性。以GAPDH为内参并以A组为对照组采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达水平。

表2 实时荧光定量PCR的引物序列Table 2 Primer sequence of real-time fluorescent quantitative PCR

1.3.4 瘤胃上皮VFA转运载体蛋白表达量测定使用蛋白抽提试剂盒提取各组牦牛肝脏组织总蛋白,蛋白提取过程中按1%比例加入蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂。测定提取的蛋白浓度(碧云天BCA试剂盒)。均一化蛋白浓度后经变性转到PVDF膜上,50 g·L-1BSA封闭1.5 h,添加一抗4 ℃摇床孵育过夜,再用TBST洗3 次,每次15 min,加二抗孵育1.5 h,TBST洗3 次,每次10 min,用ECL化学发光试剂盒进行显影。所用抗体稀释比例见表3。

表3 抗体稀释比例Table 3 Antibody dilution ratio

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 日粮精粗比对牦牛瘤胃微生物多样性的影响

2.1.1 牦牛瘤胃微生物16S rRNA测序基本数据如表4所示：A组测序产生的可见物种数量略高于B组和C组。随着日粮精料比例升高,舍饲育肥牦牛瘤胃微生物Chao1、ACE、Shannon和Simpson多样性指数均有升高趋势(P>0.05);C组细菌覆盖率略高于A组和B组。

表4 牦牛瘤胃微生物16S rRNA测序基本数据Table 4 Basic data of 16S rRNA sequencing of yak rumen microorganisms

由图1可知,3组共有OTU个数为2 032。其中A组和B组之间共有239个OTU,A组和C组之间共有198 个,B组和C组间共有213 个。A、B、C 3组特有的OTU个数分别为619、195、149。

图1 3组牦牛瘤胃微生物OTU聚类分析Fig.1 OTU cluster analysis of yak rumen microorganisms in three groups

2.1.2 日粮精粗比对牦牛瘤胃细菌相对丰度(门、属水平)的影响由表5可知,日粮精粗比显著影响舍饲育肥牦牛瘤胃细菌菌群在门和属水平的组成。在门水平上的舍饲育肥牦牛瘤胃细菌中,Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度之和比例达80%～90%,是绝对优势菌群。日粮精粗比水平对牦牛瘤胃细菌中Firmicutes、Bacteroidetes、Spirochaetes、Tenericutes和Lentisphaerae影响显著(P<0.05)。随着精料比例升高,Bacteroidetes、Spirochaetes和Lentisphaerae相对丰度显著上升(P<0.05),Firmicutes和Tenericutes相对丰度显著下降(P<0.05)。在属水平上,Prevotella、RikenellaceaeRC9gutgroup和ChristensenellaceaeR7group相对丰度较高。随着精料比例升高,瘤胃中相对丰度前10的菌属除了Ruminococcus、Pseudobutyrivibrio和Bacteroides下降外,其余均升高。

表5 日粮精粗比对牦牛瘤胃细菌门和属水平组成的影响

2.2 日粮精粗比对牦牛瘤胃发酵参数的影响

如表6所示,随日粮精料比例升高瘤胃pH值显著下调(P<0.05),乙酸浓度和乙酸浓度/丙酸浓度值显著下降(P<0.05),丙酸、戊酸和总VFA浓度显著增加(P<0.05),异戊酸浓度有上升趋势(P>0.05)。C组丁酸和异丁酸浓度显著高于A、B组(P<0.05)。

表6 日粮精粗比对牦牛瘤胃VFA含量的影响Table 6 Effect of dietary concentrate to roughage ratio on rumen VFA content of yak

2.3 日粮精粗比对牦牛瘤胃上皮VFA转运载体基因表达的影响

如图2所示,日粮精粗比显著影响舍饲育肥牦牛瘤胃上皮VFA转运载体mRNA表达量,其中DRA、PAT1、MCT1表达量显著上升(P<0.05),A组MCT4 mRNA表达量显著低于B组和C组(P<0.05),而AE2表达量显著降低(P<0.05)。

图2 日粮精粗比对牦牛瘤胃上皮VFA转运载体mRNA相对表达量的影响Fig.2 Effect of dietary concentrate to roughage ratio on relative mRNA expression level of volatile fatty acid transporter in yak rumen epithelium不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Values with different letter mean significant difference(P<0.05). The same below.

2.4 日粮精粗比对牦牛瘤胃上皮VFA转运载体蛋白表达的影响

如图3所示,随着日粮精料比例增加,牦牛瘤胃上皮VFA转运载体蛋白DRA、PAT1、MCT1、MCT4表达量显著升高(P<0.05),AE2的表达量显著降低(P<0.05)。蛋白表达趋势与mRNA的一致。

图3 日粮精粗比对牦牛瘤胃上皮VFA转运载体蛋白相对表达量的影响Fig.3 Effect of dietary concentrate to roughage ratio on relative expression of volatile fatty acid transporter protein in yak rumen epithelium

2.5 日粮精粗比对牦牛生产性能的影响

如图4所示,随着日粮精料比升高牦牛的平均日增重、饲料转化率与屠宰率显著提高,且A、B、C组间差异显著(P<0.05)。

图4 日粮精粗比对牦牛生产性能的影响Fig.4 The effect of d dietary concentrate to roughage ratio on the production performance of yaks

3 讨论

3.1 日粮精粗比对牦牛瘤胃微生物多样性的影响

影响瘤胃微生物区系的因素很多,日粮作为稳定可控的因素被广泛研究。瘤胃优势菌群随日粮结构变动而改变,当粗料比例较高时,纤维降解菌丰度增加;精料比例较高时,淀粉降解菌丰度增加[5]。随着湖羊精料比例下降,湖羊瘤胃菌群的香浓指数和辛普森指数显著降低,ACE和Chao1指数也有下降趋势[6]。本研究中,随着日粮精料水平的增加,瘤胃菌群多样性Chao1、ACE、香浓指数以及辛普森指数趋于升高,菌群检测覆盖率也升高,与上述研究结果一致。日粮中添加精料会导致犊牦牛Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度降低,Proteobacteria相对丰度升高[7]。本试验中,精料比例升高会导致Bacteroidetes相对丰度升高,推测是因为年龄或日粮结构不同所致。研究发现,随着日粮能量水平的提高,舍饲牦牛的Spirochaetes相对丰度显著提高[8];荷斯坦奶牛瘤胃Lentisphaerae的16S rRNA相对丰度随日粮中蛋白和能量水平的升高而升高,且受异丁酸、戊酸和异戊酸的影响显著[9];随着日粮中能量饲料的升高,肉牛瘤胃Tenericutes的相对丰度显著降低[10]。本试验中,随着日粮精料比例升高,舍饲育肥牦牛瘤胃内Firmicutes和Tenericutes相对丰度显著降低,Bacteroidetes、Spirochaetes和Lentisphaerae的相对丰度显著升高,与上述研究结论相一致。

本试验中舍饲育肥牦牛瘤胃Prevotella、RikenellaceaeRC9gutgroup和ChristensenellaceaeR7group相对丰度占前三。Prevotella是一种具有多种代谢功能的菌,随着日粮含氮化合物水平的提高,黄牛瘤胃Prevotella所占比例显著增加[11]。本试验中,随着精料比例升高,Prevotella相对丰度显著升高,RikenellaceaeRC9gutgroup和ChristensenellaceaeR7group在3组牦牛瘤胃中都占整个细菌菌属5%～10%。研究表明,Succiniclasticum对淀粉和糖类的降解具有重要作用[12-13];瘤胃中可溶性碳水化合物可被Treponema降解[14]。本试验中,随着日粮精料比例升高,C组牦牛瘤胃中RikenellaceaeRC9gutgroup、ChristensenellaceaeR7group、Saccharofermentans、Succiniclasticum、Treponema相对丰度显著高于A组。研究表明,Bacteroides和Ruminococcus的主要功能是降解日粮中的半纤维素和纤维素[15],Pseudobutyrivibrio的主要功能是降解碳水化合物[16]。本试验中,C组舍饲育肥牦牛瘤胃中Bacteroides、Pseudobutyrivibrio和Ruminococcus相对丰度显著低于A组,与上述文献结论一致。

3.2 日粮精粗比对牦牛瘤胃发酵参数的影响

崔安等[17]研究发现,随着日粮精料比例升高,秦川肉牛公牛、阉牛和母牛的瘤胃液pH值为6.22～6.80,且pH值随日粮精粗比的提高显著下降。孙光明等[20]研究报道,分别给西藏牦牛饲喂低精料(精粗比为40∶60)和高精料(精粗比为60∶40)日粮,各组瘤胃液的pH值为6.0～6.3,略低于正常区间,推测可能是因为日粮精料过高所致。本试验中,舍饲育肥牦牛瘤胃pH值为6.20～6.90,处于正常区间,说明日粮精粗比对舍饲育肥牦牛瘤胃发酵环境没有负面影响,且pH值随着精料比例提高显著下降。

VFA为机体生长发育提供底物,乙酸/丙酸值可反映瘤胃发酵状况[19]。反刍动物日粮中精料比例高,瘤胃发酵倾向丙酸发酵,反之则倾向乙酸发酵[20]。郭盼盼等[21]对延边黄牛的研究结果表明,随着精料比例升高,黄牛瘤胃中乙酸和乙酸/丙酸比值显著下降,丙酸和TVFA浓度显著上升,本研究结果与之一致。孙光明等[18]研究发现,提高西藏牦牛日粮精料水平瘤胃TVFA含量显著增加,但异丁酸和异戊酸在TVFA的比例显著降低,乙酸、丙酸、丁酸、戊酸比例不受日粮精粗比影响。本试验中,增加精料比例,丁酸和异丁酸含量提高,但异戊酸含量对日粮精粗比变化没有响应,这与前人研究结果不一致,推测可能与海拔和日粮组成差异有关。

3.3 日粮精粗比对牦牛瘤胃上皮VFA转运载体表达量的影响

对反刍动物瘤胃上皮在高谷物日粮饲喂中的适应机制研究发现,提高日粮精料水平,瘤胃上皮DRA和MCT1 mRNA及其蛋白表达量成倍增加[22-23],藏绵羊瘤胃上皮DRA和MCT1的mRNA表达量显著提高[24];高能组奶牛瘤胃上皮的DRAmRNA表达量相比低能组提高了约60%,而AE2表达量则下降了30%[25];饲喂35%精料组山羊瘤胃上皮的DRA、PAT1、AE2、MCT1和MCT4 mRNA表达量均显著高于饲喂10%精料组[26];奶牛瘤胃液pH值降低时,瘤胃上皮MCT1表达量上升,而AE2表达量下降[27]。本试验中,随着日粮精料比例的升高,舍饲育肥牦牛瘤胃上皮DRA、PAT1、MCT1和MCT4的基因和蛋白表达量均显著上升,AE2表达量显著下降。随着饲料中精料的比例增加,总VFA含量升高,其相应的VFA转运载体表达发生变化,与VFA的变化趋向一致。

3.4 日粮精粗比对牦牛生产性能的影响

随着日粮中精料比例逐渐增加,其对于牦牛的生产性能有显著影响。赵占强等[28]研究表明,饲喂精粗比为67.1∶32.9的饲料,牛育肥效果优于精粗比为57.0∶43.0和45.7∶54.3,日增重显著升高。杨超[8]研究结果表明,当牦牛日粮能量水平升高时,饲料转化率也随之升高。本试验结果证明牦牛在日粮精粗比为 7∶3 时平均日增重和饲料转化率最高,这与前人研究结果一致。本试验中,随着精料比例升高,育肥牦牛的屠宰率也显著升高,与姚延琴等[29]对黑山羊屠宰性能的研究结果相一致。

综上所述,在本试验条件下,当精粗比为7∶3时,牦牛生产性能提高,瘤胃产生的挥发性脂肪酸含量最高,瘤胃上皮组织中挥发性脂肪酸转运载体表达量最高,可以最大程度将挥发性脂肪酸转运入血液,为下一步机体的脂肪沉积提供底物,即育肥效果更好。