姜酚和百里香酚对白羽肉鸡小肠形态结构和屏障功能的影响

尹莉丽,吴建民,陈露,赵文轩,汪晶,朱伟云

(南京农业大学动物科技学院/国家动物消化道营养国际联合研究中心,江苏 南京 210095)

肠道在消化、营养吸收和免疫防御中起着至关重要的作用,它不仅是消化吸收营养物质的场所,还是维持机体内部动态平衡的屏障。肠道屏障是抵御肠腔内有害物质(如病原体、毒素和抗原等)结构和功能的总称,包括物理、化学、免疫和微生物屏障。研究表明,家禽生长易受营养、环境和饲养管理等因素的影响,使肠道屏障受损,表现出免疫力下降和肠道菌群失衡等,从而导致全身炎症反应、器官衰竭甚至死亡[1]。多年来,抗生素一直被用于促进家禽生长和预防疾病,然而随着抗生素对畜禽产品安全及人类健康危害的揭示,开发新型绿色安全的天然替代品成为研究热点。植物性饲料添加剂(phytogenic feed additives,PFA)因其绿色无污染,并且能够调节肠道菌群及机体免疫等[2]而被广泛应用于畜禽养殖中,发挥促进肠道健康等作用。研究发现单一植物提取物具有添加量大、效果单一的缺点,而多个提取物复合可以通过活性成分的协同作用增强其作用效果,能够更好发挥益生作用[3]。

姜酚(gingerol,Gin)是生姜中姜辣素的主要成分,包括6-姜酚(含量最高,生物活性最强)、8-姜酚、10-姜酚、12-姜酚等多种成分,在抗氧化[4]、抗炎[5]、抗菌[6]等方面发挥着重要作用。姜酚能够抑制Caco-2细胞系中的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)分泌,降低白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)等炎性细胞因子水平从而改善炎症反应,维持肠道上皮屏障功能[7]。Karangiya等[8]研究证实,生姜能显著提高肉鸡的生长性能,改善十二指肠形态结构,增加肠道吸收表面积。百里香酚(thymol,Thy)是一种从唇形科植物的挥发油中提取出的单体物质,具有广谱抑菌、消炎和提高机体抗氧化等作用。百里香酚的抗氧化特性与其酚类结构有关,酚类结构可以吸附和中和自由基并表现出氧化还原特性[9]。百里香酚具有有效清除和还原超氧阴离子、羟基自由基和DPPH自由基的能力[10],并且还能激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)信号通路从而提高抗氧化能力[11]。体外试验证明,用百里香酚预处理IPEC-J2细胞,可以通过减少上皮细胞中活性氧的产生和促炎细胞因子的表达来减轻脂多糖诱导的屏障功能损伤[12]。Du等[13]研究表明,日粮中百里香酚可通过改善感染产气荚膜梭菌的肉鸡肠道完整性和调节免疫反应来减轻肠道损伤。

姜酚水溶性差导致其生物利用度低,同时具有不稳定的β-羟基酮结构,可能会降低姜酚的药理和生物活性[14]。多项研究表明,百里香酚与丁香酚、香芹酚或肉桂醛等物质具有较好的协同作用,其原因可能是百里香酚能够破坏细菌外膜,使丁香酚、香芹酚或肉桂醛等物质更容易进入细胞质并与蛋白质结合,从而发挥协同抑菌作用,提高其生物利用度[15-18]。基于以上研究结果,我们推测姜酚和百里香酚组合可能在改善肠道健康等方面具有较好的效果。因此,本试验以1～42日龄爱拔益加(AA)白羽肉鸡为对象,研究日粮添加姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠形态结构、免疫功能以及肠道屏障的影响,为姜酚和百里香酚在肉鸡上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1日龄爱拔益加(AA)白羽肉鸡购自南京特给力种植专业合作社;姜酚(纯度≥60%)和百里香酚(纯度≥98%)均购自山西玉宁生物科技有限公司。

1.2 试验设计

试验选取200只1日龄健康状况良好、体重相近的AA白羽肉鸡,随机分为4组,每组5个重复,每个重复10只鸡,试验期为42 d。4个试验组分别为：对照(Con)组,基础日粮(不含抗生素);姜酚(Gin)组,基础日粮+60 mg·kg-1姜酚;百里香酚(Thy)组,基础日粮+30 mg·kg-1百里香酚;姜百(Gin+Thy)组,基础日粮+30 mg·kg-1姜酚+15 mg·kg-1百里香酚。

1.3 试验饲粮与饲养管理

基础饲粮参照NRC(1994)的营养需求标准配制的玉米-豆粕型饲粮。基础日粮的组成和营养水平如表1。试验采用3层笼养,试验地点为南京农业大学卫岗校区家禽养殖房。在鸡1～3日龄时,鸡舍的温度控制在32～35 ℃,后期每周降低2～3 ℃,最终温度保持在23 ℃。整个试验期间鸡舍保持24 h光照,自然通风。试验期间所有肉鸡均可自由采食和饮水,疫苗接种按常规程序进行。所有试验程序均经南京农业大学动物伦理委员会批准。

表1 基础日粮原料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.4 样品采集

在试验期第42 天每个重复选取1只接近该重复平均体重的鸡,肉鸡空腹12 h(可自由饮水)后进行屠宰采集样品。待鸡死亡后立即解剖肉鸡,用预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗干净空肠和回肠组织,用无菌载玻片刮取空肠和回肠黏膜装于2 mL无菌冻存管中,放置于液氮中保存待测;另切取空肠和回肠中间处1～2 cm的肠段,用生理盐水冲洗干净后于4%多聚甲醛中固定24 h以上。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 小肠形态结构将固定好的空肠和回肠组织样品经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色,用虚拟显微镜对染色的切片进行观察、拍照。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量绒毛高度和隐窝深度,计算绒毛高度与隐窝深度的比值。

1.5.2 小肠黏膜抗氧化酶活性称取0.2 g空肠和回肠黏膜样品,与4 ℃预冷生理盐水按 1∶9(质量/体积)的比例在冰浴条件下匀浆,然后于4 ℃、4 000 r·min-1离心10 min,取上清液保存于无菌离心管中待测。使用ELISA试剂盒检测肉鸡空肠和回肠黏膜中丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)以及总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。具体操作步骤按照说明书进行,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 小肠黏膜免疫球蛋白和细胞因子浓度称取0.2 g空肠和回肠黏膜样品,与4 ℃预冷生理盐水按 1∶9 的比例在冰浴条件下匀浆,然后于4 ℃、4 000 r·min-1离心10 min,取上清液保存于无菌离心管中待测。采用酶联免疫试剂盒(上海酶联生物科技有限公司),利用双抗夹心法测定空肠和回肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)浓度以及空肠和回肠黏膜中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)的浓度。具体操作步骤按照说明书进行。

1.5.4 小肠黏膜紧密连接和抗氧化相关基因表达使用Trizol试剂(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)分别提取空肠和回肠黏膜中的总RNA。并用Nanodrop ND-2000分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)测定RNA浓度和纯度。将符合标准的RNA稀释到同一水平浓度后使用HiScript®Ⅲ All-in-one RT Super Mix for qPCR反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将RNA反转录成cDNA,置于-80 ℃保存。参照ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行qPCR反应体系的配制,用QuanStudio7 Flex荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行荧光定量PCR反应。选用β-actin作为内参基因,使用2-ΔΔCT方法计算目的基因mRNA相对表达量[19]。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列如表2所示。

表2 实时定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for RT-qPCR analysis

1.6 数据统计与分析

试验数据用Excel 2019软件处理,运用SPSS 26.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan’] s进行多重比较。结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠形态的影响

由表3和图1可知：与Con组和Gin组相比,Gin+Thy组回肠绒隐比显著提高(P<0.05),Gin+Thy组和Thy组回肠绒毛高度和Con组相比有增加的趋势(P=0.063)。4个处理组空肠形态结构无显著差异(P>0.05)。

图1 各组肉鸡空肠和回肠组织切片Fig.1 Jejunal and ileal tissue sections of broilers in each group

表3 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠形态的影响Table 3 Effects of gingerol,thymol and their combination on the small intestinal morphology of broilers

2.2 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜免疫球蛋白和细胞因子含量的影响

由表4可知：与Con组和Gin组相比,Gin+Thy组空肠和回肠黏膜中sIgA含量显著提高(P<0.05)。与Con组相比,空肠黏膜中IL-6和IFN-γ的含量在Gin组、Thy组和Gin+Thy组中显著降低(P<0.05),回肠黏膜中IL-6和IL-1β的含量在Thy组和Gin+Thy组中显著降低(P<0.05),Thy组和Gin+Thy组回肠黏膜IFN-γ含量有降低的趋势(P=0.054)

表4 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜免疫球蛋白和细胞因子含量的影响Table 4 Effects of gingerol,thymol and their combination on immunoglobulin and cytokines contents in the small intestinal mucosa of broilers

2.3 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜抗氧化酶活性的影响

由表5可知：Gin+Thy组空肠黏膜T-AOC和GSH-Px活性显著高于Con组和Gin组(P<0.05);Gin+Thy组回肠T-AOC显著高于Con组,Gin组、Thy组和Gin+Thy组回肠GSH-Px活性显著高于Con组(P<0.05)。

表5 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜抗氧化酶活性的影响Table 5 Effects of gingerol,thymol and their combination on antioxidant enzyme activity in the small intestinal mucosa of broilers

2.4 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜抗氧化相关基因表达的影响

由图2可知：Gin+Thy组空肠黏膜的Nrf2 mRNA相对表达量显著高于Con组和Gin组,空肠黏膜的HO-1 mRNA相对表达量显著高于Con组和Thy组,空肠黏膜的GPX4 mRNA相对表达量显著高于Con组、Gin组和Thy组(P<0.05);Thy组和Gin+Thy组回肠黏膜的Nrf2 mRNA相对表达量显著高于Con组和Gin组,Gin+Thy组回肠黏膜的SOD1和GPX4 mRNA相对表达量显著高于Con组、Gin组和Thy组(P<0.05)。4个处理组空肠黏膜和回肠黏膜的的NQO1 mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。

图2 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜抗氧化相关基因表达的影响Fig.2 Effects of gingerol,thymol and their combination on expression of antioxidant related genes in the small intestinal mucosa of broilers

2.5 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜紧密连接相关基因表达的影响

由图3可知：与Con组相比,Gin+Thy组空肠和回肠黏膜中的OccludinmRNA相对表达量显著提高(P<0.05),并且Gin+Thy组回肠黏膜中的OccludinmRNA相对表达量显著高于Gin组和Thy组(P<0.05)。4个处理组空肠黏膜和回肠黏膜的ZO-1和Claudin-1 mRNA相对表达量均无显著差异(P>0.05)。

图3 姜酚、百里香酚及其组合对肉鸡小肠黏膜紧密连接相关基因表达的影响Fig.3 Effects of gingerol,thymol and their combination on expression of tight junction related genes in the small intestinal mucosa of broilers

3 讨论

空肠和回肠是养分吸收的重要场所,完整的形态结构是其高效发挥生理功能和进一步促进动物生长所必需的条件。绒毛高度和隐窝深度分别是肠道消化和吸收功能以及细胞成熟率的主要指标,绒毛高度/隐窝深度综合反映了小肠的功能状态,比值上升表示肠道消化吸收能力提高[20]。研究表明,日粮添加100 mg·kg-1植物精油(百里香酚有效含量为10%)显著提高了肉鸡空肠绒毛高度[21],而40 g·kg-1干姜粉(总多酚含量为2.7%)显著提高了84日龄珍珠鸡十二指肠和回肠绒毛高度,并显著降低了十二指肠和回肠隐窝深度[22]。在本研究中,姜酚和百里香酚组肉鸡回肠绒毛高度和对照组相比有增加的趋势,且肉鸡回肠绒隐比显著高于对照组和姜酚组。这表明姜酚和百里香酚组可以通过提高小肠绒毛高度和绒隐比来改善肠道组织形态,提高肉鸡肠道的消化吸收功能。

肠道sIgA含量以及促炎和抗炎等细胞因子含量可在一定程度上反映机体免疫功能高低。sIgA是一种主要分布在肠道黏膜层的免疫球蛋白,充当保护肠腔免受抗原和病原体侵害的第一道防线,是家禽体液免疫的主效应因子[23]。动物肠道黏膜免疫功能常与细胞因子调控的炎症反应有关。姜酚和百里香酚具有免疫调节作用：日粮添加15 g·kg-1生姜通过增强免疫细胞杀菌活性、降低NO水平和调节细胞因子表达发挥先天免疫调节作用[24];在肉仔鸡日粮中添加姜粉可提高淋巴细胞转化率,增加肉仔鸡血液中粒细胞和中间细胞数,从而提高肉仔鸡的免疫性能[25];Liang等[26]在体外试验发现,百里香酚可通过干扰NF-κB和MAPK信号通路的激活,抑制TNF-α和IL-6的表达,发挥抗炎作用。本试验结果表明,姜酚和百里香酚组能显著提高肉鸡空肠和回肠黏膜中sIgA含量,显著降低空肠黏膜中IL-6和IFN-γ含量和回肠黏膜中IL-6和IL-1β含量,表明姜酚和百里香酚组合能够通过提高免疫球蛋白含量和降低促炎细胞因子的产生对肉鸡细胞免疫和体液免疫产生明显的免疫调节作用,从而提高肉鸡小肠免疫功能。姜酚与百里香酚组合使用的效果优于单独添加姜酚或百里香酚,这可能是由于姜酚的生物利用度较低,而百里香酚与姜酚配合能够提高姜酚的利用率,具体机制还需要进一步研究。

机体正常代谢产生的适量氧自由基(ROS)对机体无害甚至有益,在多种生理过程中发挥作用,然而ROS产生过量会破坏机体正常秩序及生理代谢。动物机体中的一些关键抗氧化酶(如SOD、GSH-Px和CAT)和非酶抗氧化物(如GSH)共同调控保护细胞免受氧化应激损伤[27]。T-AOC反映总体的抗氧化能力,SOD可清除过量超氧阴离子自由基,GSH-Px能催化过氧化氢分解,均可降低ROS的水平[28]。有研究表明,姜酚的抗氧化活性与其分子结构中的酚羟基和β-羟基酮有关[29]。Masuda等[30]研究发现姜酚不仅能够提供电子,对自由基进行清除,还能够加强抗氧化物质与底物的亲和性,这可能是姜酚具有抗氧化活性的原因。百里香酚所含有的酚羟基可以作为氢供体与过氧自由基结合,阻断氧化链式反应[31],其以浓度依赖性方式显示出强效的超氧阴离子、羟基自由基和DPPH自由基清除和还原能力,并能保护脂质免受氧化损伤[10]。在本研究中,姜酚和百里香酚组合能显著提高空肠和回肠黏膜中T-AOC和GSH-Px活性,此结果与前人研究结果一致[32-33]。从分子生物学角度看,抗氧化酶活性的提高与基因转录有关。Nrf2是机体抗氧化系统中关键的核转录因子,通过与抗氧化元件的结合诱导SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的表达以及GSH的合成[34]。本研究中,姜酚和百里香酚组合可显著上调肉鸡空肠黏膜Nrf2、HO-1、GPX和回肠黏膜Nrf2、SOD1、GPXmRNA相对表达量,说明姜酚和百里香酚可通过调节Nrf2信号通路提高肠道内抗氧化酶活性,从而提高肉鸡的抗氧化能力。

肠上皮细胞间紧密连接结构是肠黏膜物理屏障的重要结构基础。闭合蛋白(Occludin)是肠道紧密连接蛋白的组成成分之一,其丢失将导致细胞旁大分子的渗透性增加[35]。研究表明,姜酚通过提高ZO-1、OccludinmRNA表达来恢复DSS诱导的结肠炎小鼠的肠道屏障[36];而百里香酚可通过剂量依赖的方式提高产气荚膜梭菌攻毒肉仔鸡回肠黏膜中OccludinmRNA表达[13]。与前人研究一致,本研究结果显示,姜酚和百里香酚组合可显著提高肉鸡空肠和回肠黏膜中OccludinmRNA相对表达量,且回肠黏膜中OccludinmRNA相对表达量显著高于单一植物提取物组,表明日粮添加姜酚和百里香酚可改善肉鸡肠道屏障功能。此外据报道,促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8可通过调节细胞骨架蛋白的重组,直接导致紧密连接蛋白的重排,从而破坏屏障功能,TNF-α则会显著破坏紧密连接蛋白的表达和分布[37-38]。肠道氧化应激也会干扰紧密连接蛋白组装,破坏肠上皮屏障功能[39]。本研究表明,姜酚和百里香酚组合能够降低促炎因子的产生并增强肠道抗氧化能力。因此,姜酚和百里香酚组合改善肉鸡肠道屏障功能可能与其能够增强肠道免疫功能和肠道抗氧化能力有关。

综上所述,日粮添加姜酚和百里香酚能改善肉鸡的空肠和回肠形态结构,提高小肠抗氧化能力和免疫功能,有助于改善肠黏膜屏障功能。姜酚和百里香酚组合的效果优于单一成分的姜酚或百里香酚,二者具有较好的组合效应。