热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响及其生物信息学分析与靶基因预测

卢佳伟,赵鹏,刘媛,魏宗友,李惠侠*

(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.太仓市农业农村科技服务中心,江苏 太仓 215400)

骨骼肌约占机体总体重的40%～60%,由肌肉纤维(也称为肌纤维或肌细胞)、脂肪组织和相关结缔组织构成,能够维持机体的运动和基础能量代谢[1]。因此,骨骼肌是动物重要的组织之一。骨骼肌的发育是一个非常复杂且精细的过程,会受到外界环境、遗传特性、基因[2-3]、短链非编码RNA(microRNA,miRNA)[4-5]、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)[6]、环状RNA(circularRNA,circRNA)[7-8]、信号通路[9-10]、转录后修饰的调控[11-12]。骨骼肌起始于体节干细胞,其分化形成肌肉祖细胞,肌肉祖细胞经过多次的增殖和分裂后,形成成肌细胞[13]。成肌细胞不断增殖为肌细胞,随后相互融合形成肌管,肌管逐渐汇合形成肌纤维,最终形成骨骼肌[14]。成肌细胞是肌肉运动和再生的关键组分,其进行增殖和分化,从而融合形成新的肌肉纤维,维持骨骼肌的健康[15]。

气候和环境条件的变化会导致环境温度的升高,当人类或动物的体温高于其恒温点时,就会出现热应激(heat stress,HS),从而影响生理功能[16]。严重或者持续的热应激会造成器官损伤甚至是致命的生理功能障碍[17]。研究发现,持续热应激会抑制小鼠C2C12细胞的增殖、分化和迁移,影响肌管的发育[18]。热应激也会诱导小鼠C2C12细胞发生凋亡,通过改变肌源性调节因子MyoD、myogenin和MyHC的表达扰乱肌管的生成[19]。持续热应激还会促进鸡成肌细胞的凋亡[20]。

miRNA是一种长约22个核苷酸、内源性启动的短链非编码RNA,其广泛表达于动物各种组织和细胞中[21]。miRNA通过与靶基因的3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)结合来负调控靶基因的表达,miRNA还会引导RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合靶基因的3′UTR,导致靶基因被降解或其翻译过程被抑制,从而实现基因沉默[22]。miRNA能够调控众多细胞过程,如细胞增殖、分化、凋亡和迁移等[23]。最近,很多研究探明了miRNA在骨骼肌发育中的调控作用,如miR-23a-5p能够促进C2C12成肌细胞的增殖,抑制分化过程[24];miR-24-3p可促进C2C12细胞的肌发生过程[25];miR-27a可促进C2C12细胞的增殖和分化[26];此外,miR-30a-5p会抑制鸡成肌细胞的增殖,促进分化过程[27]。由此表明miRNA可调控成肌细胞的生长和发育。目前,对热应激下成肌细胞增殖与分化过程的研究主要集中在小鼠C2C12细胞上,而在羊等家畜中的研究非常少,热应激对羊成肌细胞miRNA影响尚未见报道。因此,本研究以羊成肌细胞miRNA为研究对象,利用RT-qRCR探究热应激对羊成肌细胞miRNA的影响;通过生物信息学方法预测miRNA的靶基因,并对共同预测出的靶基因进行GO功能与KEGG信号通路的富集分析,为进一步探究热应激条件下miRNA调控成肌细胞的增殖与分化过程提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验所用成肌细胞分离于健康的1月龄山羊(江苏南京六合某羊场)。山羊屠宰后立即采集第13胸椎至第3腰椎的背最长肌,放入含5%(体积分数)双抗(青霉素/链霉素)的磷酸盐缓冲液(PBS)中,在 1 h 内运回实验室,分离羊的成肌细胞并进行体外培养,以完成后续试验。

1.2 试验方法

1.2.1 羊成肌细胞的分离与体外培养采取酶消化法和差速贴壁法分离羊的成肌细胞。具体步骤如下：先将肌肉组织在75%乙醇中浸泡10 s,用含5%双抗的PBS清洗3次,充分去除其表面的血迹;再将肌肉组织置于无菌平皿中,剔除筋膜和脂肪等组织,用眼科剪将肌肉组织充分剪碎,随后转移至无菌15 mL离心管中,加入适量PBS,吹打混匀,静置3 min后弃掉上清液;加入适量含0.1% I型胶原酶的DMEM/F12(DF12),37 ℃水浴锅消化1 h,每5 min上下颠倒1次,然后12 000 r·min-1离心5 min,弃上清液;加入适量0.25%胰蛋白酶,37 ℃水浴锅消化15 min,弃上清液;经70 μm细胞筛过滤后,12 000 r·min-1离心 5 min,弃上清液;最后用含20%(体积分数)胎牛血清、10%(体积分数)马血清和1%(体积分数)双抗的DF12培养基进行重悬,接种于T25细胞培养瓶,于37 ℃、5%(体积分数)的CO2培养箱中培养2.5 h,再将培养液转移至新的T25细胞培养瓶中继续培养2.5 h,最后移至新的T25细胞培养瓶,即得到纯净的羊原代成肌细胞。当细胞长满80%左右时,进行传代：弃掉原有培养基,PBS洗涤1次,加入1 mL提前预热的0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃培养箱中消化1 min,加入1 mL培养液吹打均匀终止消化,300g离心5 min,弃上清液,加入1 mL培养液重悬沉淀,1∶2传至新的细胞培养板。

羊成肌细胞增殖阶段使用生长培养液进行培养,即含20%胎牛血清、10%马血清和1%双抗的DF12,隔天换液;当细胞长满90%时,换用分化培养液诱导分化,即含2%马血清和1%双抗的DF12,隔天换液,观察肌管的生成情况。

1.2.2 羊成肌细胞的热应激处理增殖阶段热应激处理：当羊成肌细胞长满90%时,放入42 ℃、5%的CO2培养箱中培养3 h;分化阶段热应激处理：当羊成肌细胞分化出明显的肌管时放入42 ℃、5%的CO2培养箱中培养3 h。

1.2.3 免疫荧光鉴定羊成肌细胞将羊成肌细胞传至35 mm细胞培养皿中培养,取诱导分化前后的羊成肌细胞,弃掉培养基,在摇床上用PBS清洗3次,每次5 min,加入1 mL 4%多聚甲醛,4 ℃过夜后弃掉多聚甲醛。在摇床上用PBS清洗3次,每次5 min,吸干PBS。加入0.5%(体积分数)Triton X-100(1×PBS配制)室温通透20 min;在摇床上用PBS清洗3次,每次5 min,吸干PBS。用5%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭1 h。分别用PAX7(Affinity,AF7584,1∶500)、MYF5(Affinity,DF3089,1∶500)和MYHC(Abcam,Ab11083,1∶500)一抗4 ℃孵育过夜,在摇床上用PBS清洗3次,每次5 min,吸干PBS。加入荧光二抗室温避光孵育1 h,在摇床上用PBS清洗2次,每次5 min,吸干PBS。用DAPI染核避光孵育15 min,滴加防荧光淬灭剂后,在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.2.4 细胞总RNA的提取与反转录(RT)热应激后,采用Trizol法提取成肌细胞的总RNA,参照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)反转录试剂盒(南京诺唯赞)的说明书,采用茎环法合成miRNA的cDNA。试验过程：吸取1 μg细胞总RNA,加入2 μL 5×gDNA Wiper Mix,再加入RNase-free ddH2O至10 μL,吹打混匀,42 ℃反应2 min,去除基因组的DNA。反应完成后,加入1 μL Stem-loop primer(2 μmol·L-1),2 μL 10×RT Mix,2 μL HiScript Ⅱ Enzyme Mix和5 μL RNase-free ddH2O,吹打混匀,进行如下反应：25 ℃ 5 min,50 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,即得到miRNA的cDNA。最后用RNase-free ddH2O稀释3倍,-80 ℃保存。

1.2.5 miRNA的引物设计与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)依据Cleys等[28]的研究结果,选择miR-23a、miR-24、miR-26a-5p、miR-27a-5p、miR-27a-3p、miR-29c-3p、miR-30a-5p、miR-30a-3p、miR-379-5p和miR-379-3p来探讨热应激对miRNA的影响。在miRBase数据库(http：//www.mirbase.org/)中查找miRNA的成熟序列,在上海生工生物工程股份有限公司官网合成各miRNA的茎环引物、上游引物与下游引物,随后交由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

以cDNA为模板,参照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞)的说明书,对miRNA进行定量分析,采用20 μL体系：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,2 μL cDNA,0.4 μL 上游引物,0.4 μL下游引物,7.2 μL RNase-free ddH2O。RT-qPCR反应条件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40个循环;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。以U6为内参基因,每组3个重复。采用2-ΔΔCT法对miRNA的相对表达量进行定量分析。

1.2.6 miRNA的序列分析在miRBase数据库中查找山羊、人、绵羊、小鼠、大鼠、牛、鸡、野猪和家犬的miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列,并对不同物种miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列和种子序列进行分析,比较各miRNA的保守性。

1.2.7 miRNA系统进化树的构建通过MEGA X软件对miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的前体序列进行比对,计算各模型组合的贝叶斯信息准则分数(Bayesian information criterion,BIC),选择BIC最低的组合。miR-23a选用Jukes-Cantor模型,miR-24和miR-27a选用Kimura 2-Parameter模型和Gamma分布,miR-30a选用Kimura 2-Parameter模型,分别构建miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a的系统进化树。

1.2.8 miRNA的靶基因预测及功能分析利用4个在线网站TargetScan 8.0(https：//www.targetscan.org/vert_80/)、miRDB(https：//www.mirdb.org/)、miRWalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)和RNA22(https：//cm.jefferson.edu/rna22/)对hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因进行预测。

使用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov)对预测出的共同靶基因进行GO(gene ontology)功能分析和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路富集分析,只保留P<0.05的条目,并利用联川生物OmicStudio云工具绘制GO富集柱状图和因子图以及KEGG富集柱状图和因子图。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 羊成肌细胞增殖与分化阶段的判定

通过免疫荧光染色检测了成肌细胞增殖标志基因和分化标志基因的蛋白表达。如图1所示：成肌细胞增殖标志蛋白PAX7和MYF5在肌卫星细胞中表达,成肌细胞分化标志蛋白MYHC在分化后的细胞中呈阳性表达,并且能看到明显分化的肌管。以上结果表明该细胞为羊的成肌细胞,分别处于增殖阶段与分化阶段。

图1 羊成肌细胞标志蛋白的免疫荧光检测Fig.1 Immunofluorescence detection for the marker proteins of the myoblasts PAX7：配对盒转录因子7 Paired box 7;MYF5：成肌细胞决定蛋白5Myogenic differentiation 5;MYHC：肌球蛋白重链Myosin heavy chain;FITC：荧光素5-异硫氰酸酯Fluorescein isothiocyanate;DAPI：4′,6-二氨基-2-苯基吡啶4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 热应激对羊成肌细胞miRNA的影响

如图2-A所示：热应激后,羊成肌细胞增殖阶段miR-23a、miR-26a-5p、miR-29c-3p、miR-30a-5p、miR-30a-3p和miR-379-5p的相对表达量显著降低(P<0.05),miR-24、miR-27a-5p、miR-379-3p(P<0.01)和miR-27a-3p(P<0.001)的相对表达量极显著降低。如图2-B所示：热应激后,羊成肌细胞分化时期miR-23a、miR-26a-5p、miR-27a-3p和miR-379-5p的相对表达量显著降低(P<0.05),miR-24和miR-30a-5p相对表达量极显著降低(P<0.01)。上述结果说明热应激会影响羊成肌细胞部分miRNA的表达。

图2 RT-qPCR检测热应激下羊成肌细胞miRNA的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of miRNA by RT-qPCR in myoblasts under heat stressA. 增殖阶段Proliferation stage;B. 分化阶段Differentiation stage. 圆点表示每个数值。The dots indicate each value.CON：对照组Control group;HS：热应激组Heat-stressed group. *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.

2.3 miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a的序列分析

根据热应激下羊成肌细胞miRNA的RT-qPCR结果,我们选择了miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p进行后续的生物信息学分析以及靶基因预测。对不同物种miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的成熟序列进行比对,结果(表2)发现,miR-23a在不同物种的成熟序列基本相同,同源性很高,且序列长度基本相同,均为19～22 nt,其中有19个碱基保守,即第1～19位碱基,并且不同物种的miR-23a的种子序列完全一致(UCACAUU),仅3′端末尾个别碱基存在不同程度的缺失。表3展示了不同物种miR-24的成熟序列,从表中发现除了牛的成熟序列外,其余物种miR-24的成熟序列基本相同,序列长度均为 20～23 nt,其中有20个碱基保守,即第1～20位碱基,并且这些物种miR-24的种子序列完全一致(GGCUCAG),也是3′端末尾个别碱基存在缺失情况。如表4所示：miR-27a-3p在不同物种中的成熟序列也基本相同,同源性很高,且序列长度基本相同,均为20～21 nt,其中有20个碱基保守,即第1～20位碱基,并且不同物种的miR-27a-3p的种子序列完全一致(UCACAGU),只是3′端末尾C碱基存在缺失情况。表5展示了不同物种miR-30a-5p的成熟序列,从表中发现不同物种miR-30a-5p的成熟序列基本相同,序列长度均为22～24 nt,其中有22个碱基保守,即第1～22位碱基,并且这些物种miR-30a-5p的种子序列完全一致(GUAAACA),也是3′端末尾个别碱基存在缺失情况。由此说明miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p具有较高的保守性。

表2 不同物种miR-23a的序列信息Table 2 Information on miR-23a sequences in different species

表3 不同物种miR-24的序列信息Table 3 Information on miR-24 sequences in different species

表4 不同物种miR-27a-3p的序列信息Table 4 Information on miR-27a-3p sequences in different species

表5 不同物种miR-30a-5p的序列信息Table 5 Information on miR-30a-5p sequences in different species

2.4 miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a的系统进化树

利用MEGA X软件对miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在山羊、人、绵羊、小鼠、大鼠、鸡、牛、野猪和家犬等物种的前体序列进行比对分析,构建系统进化树,发现miR-23a、miR-24、miR-27a和miR-30a在进化中保守性较高,成熟序列基本相同(图3)。

图3 miR-23a(A)、miR-24(B)、miR-27a(C)和miR-30a(D)的系统进化树Fig.3 Phylogenetic trees of miR-23a(A),miR-24(B),miR-27a(C)and miR-30a(D) oar：绵羊Ovis aries;bta：牛Bos taurus;hsa：人Homo sapiens;chi：山羊Capra hircus;ssc：野猪Sus scrofa;cfa：家犬Canis lupus familiaris;mmu：小鼠Mus musculus;rno：大鼠Rattus norvegicus;gga：鸡Gallus gallus.

2.5 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因预测

通过4个在线网站工具TargetScan、miRDB、RNA22和miRWalk对hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p进行靶基因的预测,分别预测到141、317、383和11个共同靶基因(图4)。

图4 hsa-miR-23a(A)、hsa-miR-24(B)、hsa-miR-27a-3p(C)和hsa-miR-30a-5p(D)的靶基因预测Fig.4 Target gene prediction of hsa-miR-23a(A),hsa-miR-24(B),hsa-miR-27a-3p(C)and hsa-miR-30a-5p(D)

2.6 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因GO功能分析

分别对预测出的hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因进行GO功能分析,结果如图5所示。141个hsa-miR-23a靶基因显著富集在51个GO terms(P<0.05),其中生物过程 29个、细胞组分11个、分子功能11个(图5-A),并且主要富集在细胞增殖的负向调控、细胞周期和细胞迁移等过程(图5-B)。317个hsa-miR-24靶基因显著富集在123个GO terms(P<0.05),其中生物过程 73个、细胞组分28个,分子功能22个(图5-C),并且主要富集在细胞增殖的负向调控、细胞凋亡和迁移等(图5-D)。383个hsa-miR-27a-3p靶基因显著富集在185个GO terms(P<0.05),其中生物过程110个、细胞组分37个、分子功能38个(图5-E),并且主要富集在细胞增殖、周期、迁移和骨骼肌细胞分化等(图5-F)。11个hsa-miR-30a-5p靶基因富集在2个GO terms(P<0.10,图5-H),即细胞组分2个(图5-G)。GO功能分析结果提示miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p可能参与调控成肌细胞的增殖、分化、周期、凋亡、迁移等过程,进而调控骨骼肌的发育。

图5 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因GO功能分析Fig.5 GO function analysis of target genes of hsa-miR-23a,hsa-miR-24,hsa-miR-27a-3p and hsa-miR-30a-5pA,B. hsa-miR-23a;C,D. hsa-miR-24;E,F. hsa-miR-27a-3p;G,H. hsa-miR-30a-5p.

2.7 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果如图6所示。hsa-miR-23a的靶基因显著富集在2条通路上(P<0.05,图6-B)。hsa-miR-24的靶基因显著富集在19条通路(P<0.05,图6-D),如MAPK、Ras、ErbB、FoxO和PI3K-Akt信号通路。hsa-miR-27a-3p的靶基因显著富集在31条通路(P<0.05,图6-F),如mTOR信号通路、TGFβ信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、ErbB信号通路、FoxO信号通路和PI3K-Akt信号通路。hsa-miR-30a-5p的靶基因无显著富集的通路。以上结果表明miR-24和miR-27a-3p可能参与调控相关信号通路,从而影响骨骼肌的发育过程。

图6 hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p的靶基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of hsa-miR-23a,hsa-miR-24 and hsa-miR-27a-3pA,B. hsa-miR-23a;C,D. hsa-miR-24;E,F. hsa-miR-27a-3p.

2.8 hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p与靶基因、KEGG通路的关联分析

将hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p与靶基因、KEGG通路进行关联分析,从结果(图7)中发现：NLK与TAOK1是hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p的共同靶基因,可能调控MAPK与FoxO信号通路。此外,hsa-miR-24还可能通过调控PI3KR3基因的表达,来参与Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信号通路。NARS、KRAS和SOS1作为信号通路的交互靶基因,hsa-miR-27a-3p可能靶向NARS、KRAS和SOS1调控MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信号通路。以上结果说明miR-24和miR-27a-3p可能通过调控靶基因影响相关信号通路,进而调控成肌细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等过程,从而影响骨骼肌的发育。miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p对热应激下成肌细胞增殖、分化、凋亡、迁移等调控作用还需要后续的试验来深入探究。

图7 hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p与靶基因、KEGG通路的关联分析Fig.7 Correlation analysis of hsa-miR-24,hsa-miR-27a-3p with target genes and KEGG pathway PI3KR3：磷酸肌醇3激酶基因Phosphoinositide-3-kinase,regulatory subunit 3 gene;NLK：Nemo样激酶基因Nemo-like kinase gene;TAOK1：TAO激酶1基因TAO kinase 1 gene;NARS：Asparaginyl-tRNA合成酶基因Asparaginyl-tRNA synthetase gene;KRAS：Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog;SOS1：七子基因编码因子基因Son of sevenless gene encoding factor.

3 讨论

miR-23a抑制C2C12细胞的肌分化[29],miR-24促进肌分化[30],miR-27a通过靶向肌生长抑制素基因来促进猪成肌细胞的增殖[31],miR-30a家族会促进小鼠C2C12细胞的分化过程[32]。然而,目前有关热应激是否会影响miRNA表达的研究鲜有报道,热应激如何通过调控miRNA的表达来影响成肌细胞的增殖、分化、凋亡等过程也尚不清楚。本研究通过RT-qPCR技术发现热应激抑制羊成肌细胞增殖阶段和分化阶段大部分miRNA的表达,其中,miR-27a-3p的表达极显著降低。由此表明热应激会影响羊成肌细胞miRNA的表达,进而影响成肌细胞的各种生物学过程。

通过RT-qPCR试验结果,本研究筛选了4个miRNA(miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p)进行后续的生物信息学分析与靶基因预测,并利用miRBase数据库查询山羊、人、绵羊、小鼠、大鼠、牛、鸡、野猪和家犬的miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列,经过序列比对后发现miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列在各物种中基本相同,种子序列完全一致。miRNA的种子序列是miRNA 5′端第2～8个核苷酸,通常与靶基因3′UTR完全互补[33]。本研究结果表明miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p的保守性较强,其在不同物种的进化中发挥着重要作用。生物信息学分析表明山羊、人、绵羊、小鼠、大鼠、牛、鸡、野猪和家犬的miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的成熟序列都只有1条。通过miRDB、TargetScan、miRWalk和RNA22预测miR-23a、miR-24、miR-27a-3p、miR-30a-5p的靶基因,分别预测到141、317、383和11个共同靶基因。因上述数据库没有羊的miRNA信息,且羊的这4个miRNA的成熟序列与人的基本相同,故而以人miRNA的成熟序列进行预测。

GO富集分析结果表明hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-30a-5p的靶基因主要富集在细胞增殖的负向调控、细胞周期、细胞凋亡、骨骼肌细胞分化和细胞迁移等生物学过程。已有相关研究报道了上述miRNA能够调控小鼠C2C12细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等[5,10,24]。本研究KEGG通路富集分析结果表明靶基因主要富集在MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信号通路。MAPK能够调控细胞的增殖和分化等过程,细胞外信号相关激酶(extracellular signal-related kinases,ERK1/2/5)、P38 MAPK和Jun氨基末端激酶(Jun amino-terminal kinases,JNK1/2/3)都属于MAPK家族[34]。PI3K-Akt也是细胞生长的重要信号因子[35]。研究表明P38 MAPK和PI3K-Akt信号通路调控C2C12成肌细胞的增殖[36]。哺乳动物中有4个FOXO基因,即FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6,这4种转录因子参与多种细胞生物学途径[37]。Ras(H-、K-或N-Ras)是许多小GTP-结合蛋白中的一种,作为分子开关调节活性GTP-和非活性GDP的结合状态。在骨骼肌成肌细胞中,Ras被认为是一种强烈的肌生成抑制剂,调节骨骼肌祖细胞的迁移。成红细胞癌基因B(erythroblastic oncogene B,ErbB)属于表皮生长因子受体酪氨酸激酶受体家族(epidermal growth factor receptor,EGFR),该家族由ErbB1(也称为EGFR)、ErbB2、ErbB3和ErbB4组成,能够调节细胞的生长、凋亡和分化[38]。由此表明miR-23a、miR-24、miR-27a-3p和miR-30a-5p可能通过参与MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信号通路,来调控成肌细胞的增殖、凋亡和分化等过程,从而影响骨骼肌的发育。

本研究发现,hsa-miR-24和hsa-miR-27a-3p可能都会调控NLK与TAOK1基因,参与MAPK、Ras、ErbB、FoxO、PI3K-Akt和mTOR信号通路。研究发现Ras/ERK/SRF/ELK信号传导需要NLK(Nemo-like kinase)通过磷酸化SRF和拮抗SRF/MKL途径来调节骨骼肌发育,在NLK敲除小鼠中,肌纤维会肥大生长,增加肌肉和体重,表明NLK能够调节体内肌肉发育[39]。TAOK1(thousand and one amino-acid kinase 1)是步骤20p蛋白激酶家族的一部分,在丝裂原活化蛋白激酶级联的上游发挥重要作用,参与多个细胞生物学过程。TAOK1也称为PSK2、TAO1或MARKK,通过c-Jun N末端激酶和Rho激酶1参与凋亡[40]。TAOK1在炎症反应和癌症的调节过程中发挥着重要作用,已被广泛证实为癌症药物的潜在靶点[41]。然而,TAOK1是否调控骨骼肌的发育还不清楚。

综上,本研究首次探明了热应激对羊成肌细胞部分miRNA的影响并进行了生物信息学分析,预测了靶基因与调控成肌细胞的生物学功能与信号通路,但是热应激条件下miRNA的具体作用机制及其与靶基因的靶向关系还有待于深入研究。