杜仲叶不同溶剂萃取物对ACE酶活的抑制作用

王 潇,李 栋,张立攀

(河南省商业科学研究所有限责任公司,河南 郑州 450000)

现代药理学表明杜仲叶降压效果明显,有“天然降压药”之美誉,但目前关于其降压机制及作用成分尚不明确,极大地限制了杜仲叶产品的开发,因此针对杜仲叶的活性成分建立简单、系统、高效的提取、分离方法体系至关重要[1]。系统溶剂萃取法根据化学成分的极性强弱,利用不同溶剂(如石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等)将原料不同组分分离,该方法针对目标成分具有一定的初筛作用,简单快捷[2]。血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)能够催化血管紧张素Ⅰ水解成血管紧张素Ⅱ,使血管收缩,引起血压升高,因此通过抑制ACE活性可起到降血压的目的[3]。

本研究利用超声法提取杜仲叶总成分,采用系统溶剂法萃取总提取液,分别得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物,再针对不同极性部位萃取物开展ACE活性抑制及抗氧化研究,为杜仲叶的资源开发提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1原料与试剂

杜仲叶,河南芳捷农业发展有限公司;无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇,烟台市双双化工有限公司;二氯甲烷,天津市科密欧化学试剂有限公司;芦丁标准品(纯度≥98%)、没石子酸标准品(纯度≥98%),北京索莱宝科技有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、福林酚(1 moL/L)、无水碳酸钠、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基(含量>97.0%)、七水合硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢,国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜、PBS缓冲液(pH值为6.8,浓度0.01 moL/L)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid,HEPES)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine,FAPGG)、ACE酶(2.5 Units),上海麦克林生化科技。以上均为分析纯。

1.1.2仪器与设备

电子天平,上海衡际科学仪器,FA2004;分液漏斗,容量为500 mL;超声波清洗器,昆山市超声仪器,KQ-700DE;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂,RE-2000A;低温冷却液循环泵,巩义市予华科技,DLSB-10L/20;恒温水浴锅,金坛市中大仪器厂,KW-1000DC;双光束紫外分光光度计,北京普析通用仪器,TU-1901;粉碎机,小熊电器,FSJ-A03E1;Agilent technologies 1290 infinity 高效液相色谱仪,广州广电计量检测股份有限公司;酶标仪,Infinite®200 PRO)。

1.2 方法

1.2.1材料处理

参考文献方法[4],将杜仲叶洗净烘干后,粉碎过筛,精确称取3份样品,质量5 g。置于250 mL锥形瓶中分别按照1∶10、1∶8、1∶6料液比加入75%乙醇,超声1 h,合并提取液,过滤,转至500 mL圆底烧瓶,旋转蒸发,浓缩至干,加入150 mL纯净水溶解。

1.2.2不同溶剂提取物制备

将上述提取液转移至500 mL分液漏斗中,加入50 mL石油醚,充分摇匀,将分液漏斗置于铁架台上,静置等待分层,分层后,分离有机溶剂层和水层,重复上述操作2次,合并滤液,用旋转蒸发仪浓缩至无液体,置于干燥器过夜,记录空瓶初重和干燥后质量,加入12.1 mL二甲基亚砜,得到浓度为20 g/L的提取液。同理,可制得20 g/L的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液。

1.2.3总黄酮测定

参考文献方法,采用硝酸铝络合分光光度法测定[5]。准确称量芦丁标准品16.29 mg,以60%乙醇定容至25 mL,制备0.65 g/L标准液。分别吸取0、0.25、0.50、1.00、1.50 mL标准液加至10 mL容量瓶中,依次加入5%亚硝酸钠溶液0.5 mL,摇匀静置6 min,加入10%硝酸铝溶液0.5 mL,摇匀静置6 min,加入10%氢氧化钠溶液2 mL,最后用60%乙醇定容至刻度线,利用分光光度计,在510 nm波长下,测定吸光值,以芦丁浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4总多酚测定

总酚含量的测定一般采用福林酚比色法[6]。精确称量18 mg没食子酸标准品,用纯净水定容至100 mL容量瓶中,得到0.18 g/L标准液,分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL标准液于具塞比色管,依次加入福林酚试剂1 mL,摇匀,加入12 mL12%的碳酸钠溶液,以纯净水定容至25 mL,在25 ℃下避光保温2 h,于765 nm波长下测定吸光度,以没食子酸浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制标注曲线。

1.2.5绿原酸、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷含量的测定

参考张立攀等[7]研究方法,分别精确称取绿原酸(12.4 mg)、京尼平苷酸(11.3 mg)、桃叶珊瑚苷(12.7 mg)标准品于10 mL棕色容量瓶,加入甲醇溶液定容至刻度线,摇匀,得到绿原酸、京尼平苷酸混合标准液和桃叶珊瑚苷标准液。分别吸取一定体积的标准液制备20、50、100、200、500 mg/L标准液,按照色谱条件上样检测,以峰面积为纵坐标,以标准品浓度为横坐标绘制标准曲线。其参数见表1。

表1 杜仲叶活性成分标准曲线及相关系数

1.2.6DPPH·清除率的测定

参考刘俊泽等[8]研究方法,分别精确移取2g/L的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液2 mL于具塞试管中,加入0.04 g/L DPPH溶液2 mL,摇匀,静置30 min,利用紫外分光光度法,在517 nm波长下测定吸光值(A样品),60%乙醇2 mL分别和2 g/L的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液2 mL测定吸光值(A′),以60%乙醇2 mL和0.08 g/L DPPH溶液2 mL作为对照组(A对照),计算公式(1)如下:

(1)

分别移取2 mL浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L的石油醚提取液于具塞试管中,加入0.04 g/L DPPH溶液2 mL,摇匀,静置30 min,利用紫外分光光度法,在517 nm波长下测定吸光值(A样品),60%乙醇2 mL分别和浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L的石油醚提取液,测定吸光值(A′),以60%乙醇2 mL和0.04 g/L DPPH溶液2 mL作为对照组(A对照)。同理,可测的不同浓度梯度的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液对DPPH·的清除率。

1.2.7羟基自由基清除能力测定

参考刘存芳等[9]研究方法,在具塞试管中依次加入2 mmol/L硫酸亚铁溶液2 mL、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、2 g/L石油醚提取液2 mL、1 mmol/L过氧化氢溶液2 mL于37 ℃水浴中反应30 min,利用紫外分光光度法,在510 nm波长下测定吸光值Ax;在具塞试管中依次加入2 mmol/L硫酸亚铁溶液2 mL、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、纯净水2 mL,1 mmol/L过氧化氢溶液2 mL,测定吸光值为Ao;在具塞试管中依次加入2 mmol/L 硫酸亚铁溶液2 mL、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、2 g/L的石油醚提取液2 mL、纯净水2 mL,测定吸光值为Axo。计算如下:

(2)

同理,利用上述同样方法,测定不同浓度梯度的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液对羟基自由基的清除率。

1.2.8ACE抑制率的测定

参照朱启鹏等[10]研究方法,血管紧张素转化酶抑制活性的测定方法。对照孔:20 μL ACE+40 μL HEPES+50 μL FAPGG。样品孔:20 μL ACE+40 μL样品+50 μL FAPGG。在340 nm波长下,分别测定对照孔和样品孔的吸光度(a1和b1),酶标板于37 ℃条件下保温30 min后测定其吸光度(a2和b2),每个样品平行3个。对照孔的吸光度减少值A=a1-a2,样品空的吸光度减少值B=b1-b2。样品ACE抑制率的计算如下:

(3)

2 结果与分析

2.1 标准曲线及相关参数(表1)

由表1可知,所测各活性成分的回归方程,线性关系良好,R2均在0.99以上。

2.2 不同溶剂萃取物活性成分含量(表2)

黄酮类化合物属于植物次级代谢产物,广泛存在于自然界中,具有抑菌、消炎、预防动脉硬化、抗衰老等功能,是抗氧化剂的理想原料。由图表2可知,不同溶剂提取的杜仲叶总黄酮含量差异性较大(P<0.05),总黄酮含量高低顺序依次为正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物。

多酚广泛存在于自然界中,对减缓心脑血管疾病、糖尿病等发生发展具有预防作用。由表2可知,乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物多酚含量差异性不大(P>0.05),但与其他组之间存在显著性差异(P<0.05),正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物中总多酚浓度均为23.27 g/L,其次为水提取物、石油醚提取物,浓度最低的是二氯甲烷提取物。

由表2可看出,正丁醇提取物绿原酸含量最高,其次为水、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷提取物。不同提取物京尼平苷酸含量具有显著性差别(P<0.05),正丁醇中京尼平苷酸含量最高,水提取物次之,然后是乙酸乙酯提取物、石油醚提取物。京尼平苷酸具有保肝利胆功效。由于桃叶珊瑚苷含量较低,石油醚提取物中仅能够检测到48 mg/L,原因可能与桃叶珊瑚苷自身的不稳定性有关,研究表明,桃叶珊瑚苷性质活泼,比较容易降解。

综上所述,不同萃取部分的活性成分含量差异性较大,其中正丁醇提取物的黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸含量最高,适合作为杜仲叶提取溶剂使用。

2.3 不同溶剂萃取物的DPPH·清除率

大量研究表明,杜仲叶具有良好的自由基清除能力,DPPH·自由基清除率经常被用来反映一种药用植物提取物的抗氧化活性[11]。杜仲叶不同溶剂萃取物对DPPH·自由基的清除作用见表3。

表3 不同溶剂萃取物对DPPH·自由基清除率 %

由表3可知,不同溶剂提取杜仲叶提取物均能够有效清除DPPH·自由基,不同溶剂提取物按照清除率大小顺序依次为:正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>水提取物。

不同溶剂提取物对DPPH·自由基的清除能力见图1。

图1 不同溶剂提取物对DPPH·自由基的清除能力

利用origin 2019b软件中的DoseResp模型对测定值进行非线性拟合,拟合效果良好,石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物对DPPH·均有良好的清除效果,其EC50分别为0.870、5.080、0.180、0.138 g/L,水提取物的清除率较低,故没有相应的EC50,一般EC50越小代表清除能力越强,因此根据EC50大小可知其清除DPPH·能力强弱为:正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>水提取物。

2.4 不同溶剂萃取物的羟基自由基清除率

不同溶剂提取杜仲叶对羟基自由基的清除作用见表4。

表4 不同溶剂萃取物的羟基自由基清除率 %

由表4可知,杜仲叶不同溶剂提取物均能够有效清除羟基自由基,二氯甲烷提取物清除率最高,其次为水提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物。不同溶剂提取物对羟基自由基的清除能力见图2。

图2 不同溶剂提取物对羟基自由基的清除能力

由图2可知,利用origin 2019b软件中的DoseResp模型对测定值进行非线性拟合,拟合效果良好。二氯甲烷提取物、水提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物对羟基自由基的清除效果良好,其EC50分别为1.727、2.022、2.326、6.035、6.377 g/L。根据EC50大小可知其清除羟基自由基清除能力强弱为:二氯甲烷提取物>水提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物。

2.5 不同溶剂萃取物血管紧张素转化酶的抑制能力

不同溶剂萃取物对ACE的抑制率见表5。

表5 不同溶剂萃取物对ACE的抑制率 %

由表5可知,不同溶剂提取物对ACE的抑制能力有明显差异(P<0.05),乙酸乙酯提取物的ACE抑制率最高,其次为正丁醇,二氯甲烷,石油醚和水提取物的抑制能力较差。利用origin 2019b软件中的DoseResp模型对测定值进行非线性拟合,见图3。整体来看,随不同提取物浓度的增大对ACE的抑制率均呈增加趋势,说明抑制率对浓度有一定的依赖性。根据EC50大小可知,不同提取物对ACE的抑制能力大小顺序为:乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物。

图3 不同溶剂提取物对ACE的抑制率

2.6 相关性分析

相关分析见图4。杜仲叶不同溶剂萃取物中黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸含量与DPPH 自由基清除率、ACE抑制率之间均存在正相关性,黄酮、绿原酸、京尼平苷酸含量与羟自由基清除率之间为正相关,这与目前的研究较一致,黄酮、多酚一致被认为是抗氧化活性的经典物质[12]。ACE抑制率与DPPH 自由基清除率、羟自由基清除率之间为正相关,相关系数分别为0.87、0.15;综上所述,黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸可能是抗氧化的物质基础,ACE活性抑制与抗氧化能力之间有一定关联。

图4 相关性分析

3 结论

杜仲叶不同溶剂(石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水)提取物中活性成分含量差异性较大(P<0.05),其中正丁醇提取物黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸含量均为最高,桃叶珊瑚苷稳定性较差,除石油醚提取物外,其余几种提取物中含量均为0。抗氧化研究表明,正丁醇提取物对DPPH的清除能力最强为76.55%,二氯甲烷提取物对羟基自由基的清除能力最强为48.9%,乙酸乙酯提取物对ACE抑制效果最佳为71.7%。相关性分析显示黄酮、多酚、绿原酸、京尼平苷酸与DPPH·清除率、ACE抑制率之间存在正相关,可能是杜仲叶发挥作用的物质基础,ACE抑制活性与抗氧化活性之间有一定关系,需要进一步研究验证。杜仲叶作为传统中药材,至今仍具有巨大的研发价值。因此,杜仲叶的正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物可作为追踪的重要部位,其药理作用和具体机制有待进一步研究,为深入探索杜仲叶提取物化学成分有效活性的研究提供了理论依据。