土壤环境中抗生素抗性基因污染研究进展和热点分析

李泽楷,韩 淼,秦 超,胡小婕,高彦征 (南京农业大学土壤有机污染控制与修复研究所,江苏南京 210095)

自1943年青霉素被应用于临床以来,人类已经发现超过9 000种抗生素,这些抗生素被大量运用于人类疾病治疗和畜禽养殖[1]。随着抗生素的大量生产及使用,其在环境中的残留水平逐渐升高,这对细菌形成选择压力,从而促进抗药性的产生和传播,随之产生一种新的环境污染物——抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes,ARGs)[2]。ARGs来源丰富,环境分布广泛。ARGs主要污染源包括医院废水、畜牧业废水和城市污水处理厂污水等[3]。ARGs可在不同环境介质中迁移、转化,目前已遍布于水、土壤和大气中。ARGs还可通过食物链进一步侵入人体,对人类健康造成潜在危害。近年来,有关ARGs来源、传播和分布的科学问题已受到国内外学者的广泛关注。

土壤是抗生素和ARGs最大的受纳体之一,养殖场中粪肥的施用是抗生素和ARGs进入土壤环境的主要途径。土壤中ARGs种类丰富,研究发现绝大多数种类ARGs在土壤环境中均有检出[4]。例如,仅四环素类抗性基因就可检出40余种,其中,tetA、tetO、tetW和tetZ等基因最常见[5]。由于不同地区抗生素使用情况、土地利用状况和土壤理化性质有所不同,故区域内土壤中ARGs的分布与丰度也不尽相同。例如,在中国长江三角洲农业区,sul2和tetG是最常见的ARGs,其平均相对丰度分别为6.67×10-3和5.25×10-3copies/16S rRNA gene copies[6]。而在荷兰的一些地区,blaTEM、ermF和tetQ这3种ARGs较为常见,其相对丰度分别为5.5×10-2、9.3×10-2和9.3×10-3copies/16S rRNA gene copies[7]。

土壤环境与人类健康息息相关。土壤中丰富的微生物为ARGs的水平传播提供了载体。ARGs可通过“土壤—微生物—植物—动物”传播链不断累积,这不仅严重影响生态安全,也会危及上层食物链进而威胁人类健康[8]。AARESTRUP等[9]研究发现,从鸡、猪和人体分离的粪肠球菌具有相似的耐药谱和耐药基因,这说明日常饮食是ARGs进入人体的一条潜在途径,也证明ARGs可通过土壤生态系统的富集、累积以及食物链的进一步传递危害人类健康。

自ARGs在环境中被大量检出并被确立为新型污染物以来,相关研究日益增多,其中,大量研究聚焦于ARGs在土壤环境中的污染问题,取得了许多重要进展。这些研究从ARGs的来源与分布、传播与扩散、消减与治理等不同方面展开了深入探索,但截至目前,相关研究尚缺乏有效的梳理与总结。因此,该文对土壤环境中ARGs污染的研究进展和热点进行综述。首先,采用文献计量学方法,借助可视化软件,对已发表的论文进行信息挖掘,这些信息包括年发文量、发文数较多的国家,以及国家之间的合作频率等;并对高频关键词进行共现分析,揭示该领域的热点研究主题。同时,该文从检测方法、来源及分布、影响ARGs传播的因素以及消减方法4个方面梳理和分析了土壤环境中ARGs污染方面的研究进展。在此基础上,结合当前的研究热点及前沿问题,指出了未来的研究方向,期望为未来土壤环境中ARGs污染领域的研究及土壤环境中ARGs的风险管控提供理论参考。

1 文献计量分析

文献计量学分析是一种基于定量分析和统计学描述某领域内文献特征的方法。通过该分析可以了解土壤环境中ARGs污染研究的现状,并预测该研究领域未来的发展方向。

1.1 数据与方法

1.1.1数据来源

以Web of Science核心数据库和万方数据库分别作为英文和中文论文数据来源,Web of Science核心数据库的检索关键词是“Antibiotic Resistance Genes”和“Soil”,万方数据库的检索关键词是“抗生素抗性基因”和“土壤”,检索时间范围为数据库创立时至2022年4月15日,涵盖所有在标题、摘要或关键词中包含这些关键词的文章。在此步骤中,共有2 817篇英文和209篇中文文章符合标准。然后,剔除书评、会议记录和信函等非学术性质文章,并根据论文的发表标题和摘要,剔除所有研究内容与“土壤环境中ARGs污染”无关的文章。经过此步骤筛选,共有900篇文献(805篇英文研究型论文、95篇中文研究型论文)符合要求,可用于进一步分析。

1.1.2研究方法

利用Web of Science数据分析平台,分析论文的年发表量、活跃国家及研究方向。利用Scimago Graphica和VOS viewer对论文的发表国家、关键词进行分析,形成共现图谱。通过可视化分析,获取该领域研究现状和热点问题,并分析未来的发展趋势。

1.2 结果与分析

1.2.1年发文量趋势

“土壤环境中ARGs污染”研究领域年累计发文量统计结果见图1(基于筛选出的900篇文献)。根据结果可将年累计发文量趋势划分为缓慢增长期(1991—2007年)、快速增长期(2008—2015年)和急速增长期(2016至今)3个阶段。具体来说,1991—2007年,“土壤环境中ARGs污染”相关研究发展平缓,累计发文量为42篇,年均发文量≤5篇,这表明在此阶段,土壤环境中ARGs污染问题尚未引起学者们的注意;2008—2015年,该领域论文数增加至192篇,占总发文数量的21.33%;2016年之后,“土壤环境中ARGs污染”问题成为一个研究热点,得到了学术界的高度重视,这一阶段文章数量显著增长,占研究总数的74.00%,远高于前两个阶段。

截至2022年4月15日。图1 年累计发文数量及被引频次变化趋势Fig.1 The number of annual publications and their citations

论文被引频次反映了该研究方向的认可度和学术影响。如图1所示,虽然2010和2017年等年份的文章数量有所下降,但被引数量逐年持续上升,说明土壤环境中ARGs污染研究方面的论文质量有所提高且逐渐受到关注,相关领域的研究进入快速发展阶段。

1.2.2发文国家及其合作

土壤环境中ARGs污染研究已在全球范围内广泛开展。截至目前,共有72个国家参与了研究并发表论文。土壤环境中ARGs污染研究方面的论文数量排名前10位的国家见表1。其中,中国以473篇论文排名第一,占研究总数的52.56%,其次是美国(196篇,占比为21.78%),这两个国家发表的论文数量明显多于其他国家,是推动该领域发展的主要国家。中国的总被引频次最高(15 136次),其次是美国(11 223次)。由 表1可知,各国总被引频次与论文数量呈现正相关关系。然而,论文发表数量与篇均被引频次并不呈正比,各国间论文的篇均被引频次差异显著。其中,德国以84.82次的篇均被引频次排名第一,其次是丹麦(78.74次)和澳大利亚(67.38次)。值得注意的是,尽管中国的论文数量和总被引频次最高,但篇均被引频次(32.00次)并不理想,仅高于韩国(10.27次),这表明我国在提高该研究领域论文发表数量的同时,应进一步提升论文质量。

表1 土壤环境中ARGs污染研究方面的论文数量排名前十的国家Table 1 Top 10 countries based on the number of publications on ARGs pollution in soil environment

国家间的合作网络见图2,图2较好地展示了各国间关于土壤环境中ARGs污染相关研究的合作信息。由图2可知,中国与美国、英国和澳大利亚的交流最频繁。然而对于一些发展中国家,比如印度和俄罗斯,它们与其他国家的合作较为单一。随着这一领域的不断发展,这些国家应加强与其他国家的国际合作,进一步提高其影响力和学术成就。

收集了发表论文数量大于2篇的国家。不同颜色的矩形表示不同国家,矩形区域面积越大表示该国发表论文的数量越多;国家间的连接线表示两个国家之间合作发表论文的数量,连接线颜色越深表示两国间合作联系强度越高。图2 1991—2022年各国关于土壤环境中ARGs污染研究的合作情况Fig.2 Cooperation between countries on the research of ARGs pollution in the soil environment from 1991 to 2022

1.2.3主题关键词分析

关键词的变化可以体现研究主题的演变过程,可供相关领域的研究人员预测该主题未来的发展趋势。基于VOS viewer中“Co-occurrence”分析功能,对检索结果的关键词进行共现分析。图3(a)显示了69个高频(出现超过15次)关键词,这些关键词可以分为4个簇,并通过不同颜色进行区分。图3(b)显示1991—2022年这些关键词的演变过程,从紫色到黄色的变化对应了关键词出现的年份变化。

图3(a)中红色聚类的关键词包括细菌、抗生素抗性、质粒、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR反应)和基因等,表明该领域主要与携带ARGs的细菌及其在土壤环境中的活动有关;这一关键词聚类在图3(b)中的颜色接近蓝色或紫色,表明在土壤环境中ARGs污染相关研究的早期阶段重点关注了携带ARGs的土壤微生物及其环境行为。

绿色聚类的关键词包括污染物、废物、药物等与ARGs共存的常见物质,也包括兽用抗生素、土霉素、磺胺、金霉素等土壤中常见的抗生素类词汇,以及吸收、命运和消减等有关ARGs去向的词汇,这表明此聚类与土壤环境中ARGs的环境行为与消减方法有关。图3(b)中的颜色显示,这一聚类中的关键词在2018年之后成为热点,表明土壤环境中ARGs污染相关研究的热点逐步从携带ARGs的土壤微生物转变为土壤环境中ARGs的环境行为与消减方法。

蓝色聚类的高频词是污泥、家禽、粪肥、施肥、土地利用和持久性等关键词,表明该聚类研究主要集中在土壤环境中ARGs来源及在土壤中的持久性,以及农业生产活动对土壤中ARGs赋存状态的影响。图3(b)中的颜色显示,这一研究主题在2019年之后也成为一个研究热点。

黄色聚类散布在红色、绿色和蓝色聚类之间,包含丰度、重金属、水平基因转移(horizontal gene transfer,HGT)、群落和可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)等关键词,说明该聚类的主题是ARGs在土壤环境中的丰度变化与微生物群落结构和水平基因转移的关系。由图3(b)可知,这一聚类在2019年之后成为热门研究领域,表明近年来研究者重点关注ARGs在土壤环境中的传播机制及其带来的潜在风险。

2 土壤中ARGs的常见检测方法

ARGs的检测方法主要包括传统微生物培养法和分子生物学方法两类(表2)。传统微生物培养法包括纸片扩散法、稀释法和抗生素浓度梯度法。分子生物学方法包括PCR、实时荧光定量PCR、DNA微阵列和宏基因组测序4种方法。

表2 抗生素抗性基因检测方法优缺点比较Table 2 Comparison of advantages and disadvantages of the detection methods for ARGs

2.1 传统微生物培养法

传统微生物培养法(即细菌耐药性试验)是国内外实验室较常使用的检测方法。该方法的原理是基于微生物的纯培养,尽管环境中的多数微生物不能在人工条件下培养,但传统微生物培养法操作简单,成本较低,标准化程度高,因此,仍然可以在一些耐药性研究中发挥作用。传统微生物培养法也为研究耐药细菌的生理学特征提供基础。

2.1.1纸片扩散法

纸片扩散法又称作Kirby-Bauer法(K-B法),诞生于20世纪40年代。操作方法是将涂抹有适量抗菌药物的纸片贴在涂布了待测菌的培养基上,利用纸片上抗菌药物的扩散形成浓度梯度,观察纸片是否出现抑菌环,以推测药物是否抑制细菌的生长。通过抑菌环大小,可以判断药物对细菌抑制作用的强弱。

K-B法操作简便,结果稳定,价格低廉,可以自由选择抗菌药物,是实验室最经典、最常用的药敏检测方法[10]。尽管如此,K-B法尚存在诸多局限。比如,在进行结果判读时,抑菌环直径对于试验结果的影响较大。当抑菌环不明显或是当抑菌环直径位于药物敏感性试验折点附近时,容易造成比较严重的误判。此外,K-B法试验耗时长,无法进行定量分析。

2.1.2稀释法

稀释法是细菌药物敏感性定量检测的常用方法,也是最早使用的方法之一,分为肉汤稀释法和琼脂稀释法两种。该方法的原理是将菌株接种到含有一系列稀释浓度抗生素的肉汤或者琼脂培养基中,观察菌株生长状况,即可获得该菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC)。

肉汤稀释法重复性好,且一次可检测多种抗生素的MIC,检测准确性和效率均较高。该方法操作简便,成本较低,所用抗生素平板可以提前配制并冷藏待用。但肉汤稀释法难以用肉眼判断杂菌,不易判读MIC。而琼脂稀释法能够观察细菌生长情况,与肉汤稀释法相比,可以精确观察到MIC值,同时还能观察试验中是否出现杂菌污染。因此,琼脂稀释法的检测结果也常常被用作其他方法的参考结果。但该方法工作量较大,费时费力,因此在部分菌株的耐药性试验中,琼脂稀释法具有局限性。

2.1.3抗生素浓度梯度法

抗生素浓度梯度法(E-test法)结合了纸片扩散法和稀释法两种方法的原理和特点。该方法操作简便,在E-test试纸上涂上事先准备好的抗生素,其浓度由一头向另一头呈指数增长。将试纸贴在细菌平板中过夜,平板上就会形成抑菌圈,圈边缘与试纸相交处的刻度即为MIC值。E-test法兼具纸片扩散法和稀释法的优点:操作简便,精确度高,重复性强,并可以用于直接测定细菌的MIC。但E-test试纸较贵,使用成本较高。

2.2 分子生物学方法

近年来分子生物学方法得到飞速发展,已成为检测环境样品中ARGs污染的主要方法。此类方法不需要传统微生物的培养和筛选过程,因此对环境样品中的可培养微生物和不可培养微生物均可以进行耐药性检测,其检测结果更加全面、可信。

2.2.1PCR

PCR技术是基因检测的常用方法,其原理是基于对特定核苷酸序列的指数型扩增。该方法无需对微生物进行分离培养,即可快速检测目标基因。目前,PCR法已经广泛用于土壤样品检测。PCR技术不仅能单独用于ARGs分析,也能与其他方法相结合。比如PCR结合传统微生物培养法,能用于检测纯菌株所携带的ARGs。PCR法检测效率高,但其检测过程中可能会有假阳性结果出现,因此,常常还需配合DNA测序来识别特定的ARGs。

2.2.2实时荧光定量PCR

PCR法主要通过凝胶电泳对ARGs进行定性分析,因此,只能检测环境中是否存在ARGs,并不能做定量化分析。在此基础上,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q-PCR)成为近年来广泛使用的ARGs检测手段。该方法结合了普通PCR和荧光能量传递技术的原理,借助荧光信号来检测PCR产物。当荧光探针与产物结合后,被激发的荧光强度和扩增产物的量呈正比,因此可以实现精确定量。

q-PCR法实现了PCR法从定性分析到定量分析的进步,其重复性好,稳定性强,但由于染料SYBR Green Ⅰ特异性较差,能够和任何DNA双链结合,因此与PCR检测类似,q-PCR法依然会产生假阳性信号。而且传统q-PCR法只能同时对几种或者几十种ARGs进行定量分析,其效率在一定程度上较低。新发展的高通量荧光定量PCR技术(high-throughput quantitative PCR)弥补了这种不足,该技术最多可支持上百种ARGs的同时定量检测,大大提高了分析效率。比如,ZHU等[4]利用高通量荧光定量PCR技术,分析了来自养猪场粪便、堆肥以及施肥土壤样品中可能存在的244种抗生素抗性基因,共检测出其中的149种,基本涵盖目前常见的ARGs类型。

2.2.3DNA微阵列

DNA微阵列技术(DNA microarray)具有快速、高效、自动化的特点,其原理是将已知序列的探针固定在微型芯片上,再将其与样本中的DNA核酸序列进行杂交,从而快速检测样本中的大量基因。

由于土壤样品基质复杂,一些污染物的存在可能会干扰检测结果,因此,该方法在临床医学上应用较多,而在环境领域应用较少[11]。由于该技术检测限度较低,单独使用该方法的检测效率低下,因此DNA微阵列技术往往还需要与PCR法相配合。

2.2.4宏基因组测序

宏基因组学是对环境中所有遗传物质的总DNA进行分析的研究集合。宏基因组测序主要分为3步:(1)宏基因组DNA的提取和纯化;(2)宏基因组文库的构建;(3)宏基因组文库的筛选和分析。宏基因组测序不仅可以检测已有的ARGs,也可以发掘环境中新出现的ARGs,丰富基因库,以便更加全面地了解ARGs多样性。宏基因组测序不依赖于微生物的培养和筛选,可以用于检测样品的全部DNA,避免了实验操作和引物选择造成的误差。因此,尽管宏基因组测序成本高,数据分析量大,但该方法依然在ARGs检测和筛选中具有良好的前景。

3 土壤环境中ARGs污染的来源及分布

土壤中ARGs分布十分广泛。如表3[6-7,12-17]所示,7个大洲的土壤均显示有一定丰度的ARGs。土壤中ARGs的全球分布与人类活动密切相关,在城市居民区、农田和养殖场等人类活动频繁的场所土壤中均发现了较高水平的ARGs。然而,在人口密度较低的地区也可能存在一定水平的ARGs。比如人类活动有限的南极偏远地区土壤中共检测出177种天然存在的ARGs[18],这表明ARGs在全球土壤环境中广泛存在。

表3 土壤环境中ARGs分布和丰度[6-7,12-17]Table 3 Distribution and abundance of ARGs in the soil environment

自然环境中ARGs来源分为内在抗性和外源输入两类。内在抗性指细菌因突变而使其基因组上的抗性基因原型表达,从而产生可水解抗生素的酶或细胞外排泵,有效分解和清除细胞内的抗生素,使细菌显现出抗生素抗性。内在抗性是微生物在自然选择过程中产生的,有利于微生物更好地适应环境。许多土壤土著微生物能代谢产生抗生素,因此土壤中天然存在ARGs。ZHANG等[19]分析了人类活动较少的冰川土壤和永冻土层,发现多种ARGs的存在,这表明ARGs早于人类抗生素使用之前就在环境中存在。但由内在抗性产生的ARGs浓度在环境中非常低,因此目前土壤环境中ARGs污染以外源输入为主,这种外源输入主要源于人类社会的生产和生活活动。

畜禽养殖业抗生素的滥用导致畜禽粪便中含有大量抗生素、抗生素耐药菌(antibiotic-resistant bacteria,ARB)和ARGs。当畜禽粪便及其堆肥产品被用作有机肥施入土壤后,其抗生素残留会对土壤微生物施加持久性压力,诱导其体内耐药性基因表达,从而增加土壤环境中ARGs丰度。ZHAO等[20]通过研究山东省长期施用粪肥的土壤,发现长期施用含有磺胺类抗生素粪肥的土壤中ARGs种类和丰度相较于未施肥的对照组显著增加,表明磺胺类抗生素可以诱导ARGs的出现。此外,粪便及其堆肥产品中ARGs种类丰富,这些ARGs会随粪肥施用直接进入土壤中。SCHMITT等[21]对比了猪粪施用前后土壤中ARGs种类变化,发现四环素类抗性基因tetY、tetS、tetC、tetQ和tetH未出现在对照组土壤中,但却在猪粪及猪粪施用土壤中检出,表明ARGs可以随着施肥过程进入土壤。

废水是土壤环境中ARGs污染的另一重要来源。再生废水灌溉实现了水资源的循环利用,在一定程度上缓解了用水压力。然而现有的污水处理系统并不完善,来自医疗系统和养殖场的污水中存在大量抗生素和ARGs,其无法通过污水处理系统彻底去除。这些富含抗生素和ARGs的再生废水一旦浇灌土壤,无疑会引入大量ARGs污染[22]。BOUGNOM等[23]测定了非洲3个地区废水灌溉农田中ARGs丰度,发现ARGs绝对丰度相较于对照组提高27%。污水处理过程中产生的活性污泥也是土壤中ARGs的一个来源,其主要通过污泥农用方式进入农田土壤生态系统。RAHUBE等[24]分析了加拿大安大略省试验田中活性污泥施用地块以及该地块收获的蔬菜样品中ARGs丰度,发现相较于未施用地块,污泥施用地块土壤和蔬菜样品中ARGs丰度显著增加,表明活性污泥中ARGs可以向土壤和蔬菜中转移,具有生态风险。

4 影响土壤环境中ARGs传播的因素

土壤环境中ARGs污染的广泛分布往往来自于ARGs的易传播特性。水平基因转移是土壤中ARGs传播扩散的主要方式之一,指ARGs通过接合、转导、转化等方式在微生物间传递的过程。在这一过程中,ARGs多负载于MGEs上。由于HGT常发生于开放的自然环境中,因此,这一过程易受多种因素影响,包括土壤中与ARGs共存的其他物质的影响以及土壤本身理化性质的影响。文献计量学调查显示,与ARGs在土壤环境中传播相关的论文共有41篇,仅占论文总数的4.56%。因此,尽管土壤环境中ARGs污染研究逐年增加,关于影响ARGs在土壤中传播的因素研究依然处于不断的探索之中。

4.1 抗生素

ARGs的HGT过程受土壤环境中抗生素的影响,共有9篇论文关注了这一影响因素。抗生素在土壤环境中的迁移、转化,不仅会诱导产生ARGs,也会对ARGs的传播表现出促进作用。卢文强等[25]发现低浓度磺胺类抗生素使大肠杆菌(Escherichiacoli)接合转移频率显著增加,这是由于此类抗生素引起了宿主细胞内DNA和蛋白质的损伤从而触发细菌的DNA损伤诱导(SOS)反应。细菌利用SOS应激反应系统修复损伤,该系统也可同时诱导MGEs发生转移,从而促进ARGs的HGT过程[26]。此外,喹诺酮类、β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素均被发现可以诱导SOS反应,从而促进HGT[27]。

4.2 重金属

重金属在土壤环境中广泛存在,部分重金属与ARGs丰度之间存在显著相关性,重金属污染土壤中ARGs转移效率也显著提高。依据文献计量学调查结果,共有16篇论文研究了重金属对土壤环境中ARGs水平转移过程的影响。杨统一等[28]基于室内培养法,发现Zn的胁迫可以提高供试土壤中ARGs相对丰度,且高浓度Zn离子可以促进ARGs的扩散。这是因为一些MGEs是ARGs和重金属抗性基因的共同载体,在重金属暴露下这些MGEs丰度会显著提升,进而相应提高ARGs发生水平转移的频率[29]。HU等[30]研究了长期Ni暴露下土壤中ARGs和MGEs丰度变化,结果显示ARGs多样性和丰度随着Ni浓度增加而增加,且MGEs丰度与ARGs丰度之间呈正相关关系,表明Ni暴露会增加ARGs水平转移的能力。

4.3 持久性有机污染物

持久性有机污染物(persistent organic pollutants,POPs)对微生物、动植物甚至人类健康均会造成不利影响。常见的有机污染物包括多环芳烃、多氯联苯等。POPs影响ARGs水平转移的机制主要有:(1)引起细胞SOS反应[31];(2)改变细胞膜通透性,使ARGs水平转移频率增加[32];(3)调控MGEs,微生物抵抗POPs的选择性压力时,会相应提高POPs降解基因所在的MGEs丰度,这同时会增加处在同一MGEs中的ARGs丰度[33];(4)增强细胞感受能力,从而使其摄取更多ARGs来抵抗外界压力[34]。文献计量学调查显示,仅有5篇论文报道了POPs对ARGs传播的影响。尽管土壤环境中POPs的界面行为已得到广泛且详细的研究,但对于POPs如何影响ARGs的迁移转化过程仍需进一步探索。

4.4 其他环境因素

土壤的理化性质也会影响ARGs在土壤中的传播,文献计量学调查显示共有11篇论文分别从土壤pH、质地、水分含量等角度探究了ARGs在土壤中的迁移。土壤pH、水分等因素能够改变土壤养分的有效性,从而影响土壤微生物群落活性,影响ARGs在土壤环境中的传播。LI等[35]研究表明,酸性条件可以促进四环素类和β-内酰胺类ARGs的HGT过程,这是因为酸性条件可以促进细胞膜通透性增加,从而增加质粒的转移。WANG等[36]研究表明土壤水分含量达到20%时发生HGT的效率最高。

5 土壤环境中ARGs消减方法

为了减少土壤中ARGs污染,降低ARGs带来的环境风险,目前学者已研发出各种ARGs消减技术,比如堆肥、生物修复法、添加外源物质及改变土壤理化性质等。在笔者所筛选出的900篇文献中,共有62篇(6.89%)文献报道了各类方法对于土壤环境中ARGs的消减作用。

5.1 堆肥

好氧堆肥和厌氧消化是畜禽粪便无害化处理和资源化利用的常用方法,它们主要通过提高温度抑制微生物生长繁殖并破坏其细胞分子结构来消减ARGs污染。在所筛选的文献中,共有9篇论文关注堆肥过程对粪肥中ARGs的去除效果及后续施用土壤中ARGs污染状况。研究发现,高温可以有效降低ARGs种类和丰度,表明无论是好氧堆肥还是厌氧消化,提高温度并延长反应时间均能有效提高ARGs去除率[37-38]。此外,堆肥过程中添加外源物质也可有效提高ARGs的去除效果。WANG等[39]发现堆肥过程中添加玉米芯颗粒显著降低堆肥产品中和随后施用的土壤中ARGs相对丰度和多样性。但尽管如此,堆肥过程仍然难以彻底去除产品中所有的ARGs,粪肥仍然是ARGs的重要储存库。

5.2 生物修复法

前述文献调研结果显示,研究或提及“土壤中ARGs的生物修复法”的文献仅有15篇,共涉及11种不同的动物、植物和微生物,这表明针对ARGs污染土壤的生物修复法研究尚处于初探阶段。生物修复相对于其他方法的优势在于其可利用自然环境中对ARGs表现有耐受性的动物、植物和微生物实现对ARGs的强效去除,可以在一定程度上避免由其他修复方法带来的对土壤本身性质的不良影响。

目前,植物修复多被用于治理土壤中的重金属和POPs污染,其对ARGs的去除已被研究者关注,但相关研究仍处于初步阶段。CUI等[40]将多花黑麦草和印度芥菜间作于ARGs污染土壤,发现多花黑麦草根际土壤中ARGs丰度降低20.43%,印度芥菜非根际土壤ARGs丰度降低23.22%。尽管试验结果表明植物具有修复ARGs污染土壤的潜能,但在应用上依然面临诸多问题。植物对野外实际环境的适应性以及食草动物、土壤病原菌的威胁都是利用植物修复ARGs污染环境所面临的挑战,这些因素很有可能导致修复效果与实验室中的结果存在差异。

蚯蚓是大型土壤动物,具有发达的肠道系统,常被用作污染土壤动物修复的模式生物。大量研究表明蚯蚓对重金属和POPs污染土壤具有良好的修复效果,近年来有学者发现蚯蚓对ARGs污染土壤也具有一定的修复能力。CHAO等[41]采集中国长江三角洲的森林土壤,探究了添加蚯蚓对四环素和ARGs污染土壤的修复效果,结果发现添加蚯蚓后的土壤中ARGs和ARB丰度相较于没有添加蚯蚓的土壤有所降低。这是由于蚯蚓肠道中的微生物相较于土壤微生物具有更强的降解四环素的能力,进而减少四环素的选择压力。

土壤中微生物具有繁殖强、代谢快的特点,在用于土壤污染治理的生物修复技术中优势显著。将特异性菌群应用于土壤可以实现土壤中ARGs的降解。SHI等[42]从活性污泥中分离出烟草节杆菌OTC-16(ArthrobacternicotianaeOTC-16)用于降解四环素和土霉素。该菌在一定的生长适宜范围内可以促进粪肥中四环素和土霉素的去除,最高达到91.54%。由于抗生素的选择压力减小,因此该菌同时可显著降低ARGs丰度。

5.3 添加外源物质

添加外源物质也是控制农田土壤ARGs污染的一项有效措施。其中,生物炭是较常添加的一类物质,文献调查结果显示,在涉及利用外源物质降低土壤环境中ARGs污染的27篇论文中,有13篇(48.15%)与生物炭相关。这表明生物炭在去除土壤环境中ARGs方面具有广阔的应用前景。此外,土壤改良剂也是修复ARGs污染土壤的常用材料。WANG等[43]利用负载了沸石的鸟粪石作为土壤改良剂,处理微塑料污染土壤中Cu、四环素和ARGs的复合污染。通过处理,土壤中ARGs总相对丰度降低76.2%～80.3%。经分析发现,该土壤改良剂的施加改变了污染物生物利用度、土壤性质和土壤微生物群落结构,进而减少污染土壤中ARGs的增殖。

5.4 改变土壤理化性质

改变土壤理化性质主要是为了阻断土壤中ARGs的扩增与传播,此次调查中共有9篇论文是关于土壤含水量、厌氧条件等因素对于ARGs去除效率影响的研究。通过改变土壤理化性质,可以有效降低土壤微生物数量和活性,从而改变土壤中ARGs转移扩散能力。比如,土壤厌氧条件有利于ARGs的消减。XU等[44]比较了土壤有氧和厌氧条件下ARGs丰度,结果发现在有氧条件下,土壤中ARGs和MGEs丰度显著高于厌氧条件,这表明改变土壤含氧状态可以在一定程度上降低农田环境中ARGs的污染风险。

6 总结与展望

以文献计量学理论为基础,借助Scimago Graphica、VOS viewer等软件,系统地分析了来自Web of Science核心数据库和万方数据库的900篇论文,以图谱形式展现并剖析了有关土壤环境中ARGs污染研究的文献产出特点和研究热点。

土壤环境中ARGs污染研究的发展可分为缓慢增长期(1991—2007年)、快速增长期(2008—2015年)和急速增长期(2016至今)3个阶段。从发文国家来看,中国、美国是该研究领域较为活跃的两个国家,研究成果多,影响力大。各国之间在该研究领域的合作较多,但部分发展中国家还应加强与其他国家的合作研究。目前,该领域的研究方向主要集中在5个方面:土壤中携带ARGs的微生物及其在土壤环境中的活动行为、土壤环境中ARGs的来源和持久性、土壤环境中ARGs的传播和消减策略、土壤中共存物质对ARGs丰度和迁移行为的影响以及农业生产活动对土壤环境中ARGs污染的影响。

在文献计量学分析的基础上,结合近年来土壤环境中ARGs污染研究的相关论文,总结归纳了土壤环境中ARGs的常见检测方法、来源和分布、影响ARGs传播的因素以及ARGs的消减方法。虽然目前土壤环境中ARGs污染研究日益丰富,相关理论体系趋于成熟,但仍然有诸多问题亟待解决。比如,ARGs通过HGT过程在土壤中传播,这一过程受诸多因素共同影响,然而目前研究仅考虑单一影响因素,尚未探究复合影响因素的共同作用,建议今后相关研究的开展可以充分考虑土壤环境的复杂性。关于ARGs污染土壤的修复,目前相关消减技术多处于理论研究阶段,如何将其规模化运用于ARGs污染土壤并取得良好的修复效果仍需更多的探索与实践。