烟草未授粉子房离体培养诱导胚状体的影响因素研究

曹景林，王 欣，程君奇，李亚培，吴成林，张俊杰，蔡长春

烟草未授粉子房离体培养诱导胚状体的影响因素研究

曹景林，王 欣，程君奇*，李亚培，吴成林，张俊杰，蔡长春

（湖北省烟草科学研究院，武汉 430030）

源于未授粉子房的雌性单倍体在烟草育种利用价值上优于源于花药或小孢子的雄性单倍体，开展烟草未授粉子房的离体培养对烟草单倍体育种具有重要意义。为了建立未授粉子房离体培养技术体系，分别以不同的杂种F1代为试材，采用HW培养基探讨了消毒方法、接种方式、接种密度、无机盐浓度、外源激素配比和琼脂浓度6个关键因素对胚状体诱导的影响。结果表明：花蕾不需剥开花瓣而直接放入0.1%升汞中浸泡8 min，剥开子房壁并横切子房后接种，每个125 mL三角瓶中接种2块子房，培养基中无机盐浓度额外增加60%、附加IAA 0.5 mg/L和6-BA 2 mg/L或者附加KT 2.0 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L、琼脂浓度9 g/L有助于对胚状体的诱导。据此进一步完善了烟草未授粉子房离体培养过程中的技术参数。

烟草；未授粉子房；离体培养；胚状体；影响因素

通过诱导单倍体再加倍能够快速缩短育种时间，是目前作物快速、高效的育种途径之一[1]。单倍体植株通常可以由花药或小孢子体外培养诱导产生，称作雄性单倍体；也可以由子房或胚珠离体培养诱导产生，称作雌性单倍体[1-2]。与花药或小孢子培养相比，经未授粉子房或未受精胚珠离体培养诱导的烟草雌性单倍体植株至少有3个独特的优点：（1）烟草雄性单倍体经染色体加倍后往往产量和品质性状劣变严重，而雌性双单倍体不会造成产量和品质的劣变，若采用杂交种未受精的卵细胞培养，则获得的双二倍体品系与常规自交相似，因而比雄性单倍体更具有育种利用价值[3-5]；（2）由于未授粉子房或未受精胚珠离体培养不牵涉花粉，因而能够适用于雄性不育植物[6]，即使单倍体植株经染色体加倍后得不到种子，也可利用组培技术繁殖种苗；（3）培养F1代的未授粉子房或未受精胚珠，可迅速获得高纯度种质资源，对提高种质资源利用率和育种效率具有理论研究和实际应用价值[7]。基于此，国内外学者越来越重视烟草未授粉子房或未受精胚珠的离体培养，并在此方面做了许多探索性工作。

Burk等[8]于1979年开始烟草未授粉子房培养研究，并成功获得了单倍体植株。祝仲纯等[9-10]采用H培养基（附加生长素IAA 0.5 mg/L和细胞分裂素KT 2 mg/L）对普通烟草品种Copusyeusuheku No.4、NC2326和革新五号的未授粉子房进行了离体培养，采用N6培养基（附加生长素IAA 0.5 mg/L、细胞分裂素KT 6 mg/L、肌醇100 mg/L和蔗糖8 g/L）对大叶黄烟的未授粉子房进行了离体培养[11]，均获得了单倍体植株。吴伯骥等[12]采用改良的H培养基（附加生长素IAA 0.5 mg/L和细胞分裂素KT 2 mg/L）对普通烟草品种柳叶烟、金星烟、黄苗榆和黄花烟草品种甘肃黄花烟的未授粉子房进行离体培养，也获得了单倍体植株。潘莉等[13-14]曾以H培养基为基础，探讨了基因型、外源激素、蔗糖、活性炭、椰胚乳、光照强度等因子对单倍体诱导率的影响。本研究组也以H培养基为基础，探讨了未受精胚珠离体培养适宜的子房发育时期和培养基类型[3]。为了建立稳定的烟草未授粉子房离体培养技术体系，提高胚状体诱导频率，本研究对前人研究[3, 9-14]中尚未涉及的消毒方法、接种方式、接种密度、无机盐浓度、其他外源激素配比、琼脂浓度等技术因子对胚状体诱导率的影响进行了探讨，以期进一步完善烟草未授粉子房离体培养过程中的技术因素参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用云烟87×吉烟9号，K346×6388和Coker371Gold×龙江911这3个杂种F1代的未授粉子房为材料。为了保证整个试验期间均能得到子房，将3个杂交组合F1代分三期于温室内播种和盆栽，间隔60 d，采用的栽烟盆内径为30 cm，每次盆栽100株。

1.2 试验方法

根据本研究组先前的研究结果，选取花冠即将露出花萼时期的子房作为外植体[3]，以由吴伯骥等[12]改良的H培养基（用HW表示）为基本培养基，附加IAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L、琼脂8 g/L 和蔗糖20 g/L。在未授粉子房的离体培养过程中，设置外植体不同消毒方法、接种方式和接种密度，以及培养基不同无机盐浓度、外源激素配比和琼脂浓度对胚状体诱导影响的试验。培养基中所有激素和氨基酸在灭菌前加入，并用40 g/L NaOH调节pH至5.5，高温高压灭菌15 min。采用125 mL三角瓶进行子房培养，每个三角瓶中倒入约30 mL培养基。胚状体诱导培养在光照培养室中进行，培养温度为（28±2）℃，光照强度为1500 lx，光照时间为12 h/d。培养过程中时常观察子房发育状况，培养25 d左右统计试验结果。各试验过程均在无菌条件下进行。

1.2.1 外植体不同消毒方法对胚状体诱导的影响 以Coker371Gold×龙江911为材料，将所采集的花蕾分别采用以下4种方式进行消毒：（X1）不剥开花瓣，将花放入70%酒精浸泡30 s，0.1%升汞灭菌8 min；（X2）不剥开花瓣，将花放入0.1%升汞浸泡8 min；（X3）剥开花瓣，将子房放入70%酒精浸泡30 s，0.1%升汞灭菌8 min；（X4）剥开花瓣，将子房放入0.1%升汞浸泡8 min。接着用无菌水冲洗 3 次，对于采用方式X1和X2进行消毒的花蕾，在垫有滤纸的无菌培养皿上将花蕾基部横切，用镊子将子房从底部挤出，轻轻剥开子房壁，横切子房后接种至HW培养基；对于采用方式X3和X4进行消毒的子房，用镊子轻轻剥开子房壁，横切子房后接种至HW培养基。每个三角瓶中接种2块子房，每个处理接种5瓶。

1.2.2 外植体不同接种方式对胚状体诱导的影响 以K346×6388为材料，将所采集的花蕾首先按X1消毒方式进行消毒处理，然后，在垫有滤纸的无菌培养皿上将消毒后的花蕾基部横切，用镊子把子房从底部挤出，分别按以下5种方式接种至HW培养基上进行培养：（S1）不剥开子房壁，直接接种至培养基；（S2）不剥开子房壁，横切子房再接种至培养基；（S3）剥开子房壁，直接接种至培养基；（S4）剥开子房壁，横切子房再接种至培养基；（S5）剥开子房壁，切碎子房后接种至培养基。每个三角瓶中接种2块子房，每个处理接种5瓶。

1.2.3 外植体不同接种密度对胚状体诱导的影响 以云烟87×吉烟9号为材料，将所采集的花蕾先按X1消毒方式进行消毒处理，然后采用S4接种方式将子房按以下5个不同密度分别接种至HW培养基上进行培养：（D1）1块子房/瓶；（D2）2块子房/瓶；（D3）3块子房/瓶；（D4）4块子房/瓶；（D5）5块子房/瓶。每个处理接种20块子房。

1.2.4 培养基不同无机盐浓度对胚状体诱导的影响 以云烟87×吉烟9号、K346×6388、Coker371Gold×龙江911为材料，将所采集的花蕾先按X1消毒方式进行消毒处理，然后采用S4接种方式将子房分别接种至如表1所示的3种培养基上进行培养。每个三角瓶中接种2块子房，每个培养基接种20瓶。

1.2.5 培养基不同外源激素配比对胚状体诱导的影响 以云烟87×吉烟9号为材料，将所采集的花蕾先按X1消毒方式进行消毒处理，然后采用S4接种方式将子房分别接种于附加有不同外源激素配比的HW培养基上。共设置如表2所示的16种外源激素配比。每个三角瓶中接种2块子房，每个处理接种10瓶。

表1 培养基不同浓度无机盐配方

1.2.6 培养基不同琼脂浓度对胚状体诱导的影响 以云烟87×吉烟9号为材料，将所采集的花蕾先按X1消毒方式进行消毒处理，然后采用S4接种方式将子房分别接种于琼脂浓度不同的HW培养基上进行培养。琼脂浓度设置4个不同的梯度：（A1）7 g/L；（A2）8 g/L；（A3）9 g/L；（A4）10 g/L。每个三角瓶中接种2块子房，每个处理接种10瓶。

2 结 果

2.1 外植体不同消毒方法对胚状体诱导的影响

外植体的不同消毒方法对胚状体的诱导效果有所差异。从表3可以看出，4种消毒方法在子房污染率上差异不大，在2种不剥开花瓣处理X1和X2以及2种剥开花瓣处理X3和X4中，升汞灭菌前是否先用酒精浸泡对胚状体诱导率也无太大影响。但是否剥开花瓣对胚状体诱导率则有明显影响，2种不剥开花瓣灭菌处理的胚状体诱导率接近或达到90%；而2种剥开花瓣灭菌处理的胚状体诱导率则明显下降，分别为55.56%和77.78%。综合来看，在4种消毒方法中，不剥开花瓣，也不用酒精浸泡，而将花蕾直接放入0.1%升汞中浸泡8 min为最优。

2.2 外植体不同接种方式对胚状体诱导的影响

外植体接种方式不同，其对胚状体诱导的影响也不同（表4）。不剥开子房壁而直接接种至培养基的方式未观察到胚状体产生，虽然接种5 d后子房有明显膨大，但同时子房壁增厚，逐渐呈现翠绿色的玻璃化状态，胚珠发育受到抑制，最后褐化死亡。不剥开子房壁，但横切子房接种至培养基，5 d后子房膨胀，在切口处有胚状体产生，但子房壁仍然变绿增厚、玻璃化严重，抑制胚珠发育。剥开子房壁，将整个子房接种至培养基，5 d后子房缓慢膨胀，胚珠虽有发育但比较缓慢，10 d后子房底部褐化严重。剥开子房壁，并将子房切碎成小块接种至培养基，5 d后大部分外植体褐化死亡，胚状体诱导率仅为30%。相比较而言，剥开子房壁，并横切子房的诱导效果最好，接种5 d后，子房膨胀，胚珠也有明显发育。接种10 d后，大部分子房能产生胚状体，诱导率达到90%。

2.3 外植体不同接种密度对胚状体诱导的影响

外植体的接种密度对胚状体的诱导也有影响，统计结果（表5）表明，子房接种密度由1块/瓶增加到2块/瓶时，胚状体诱导率由82.35%增加到90.00%。而后，随着接种密度的增大，胚状体诱导率开始逐渐下降，当接种密度增加到5块/瓶时，胚状体诱导率下降到52.94%。可见，采用2块子房/瓶的接种密度最优。

表4 子房不同接种方式对胚状体诱导的影响

表5 子房不同接种密度对胚状体诱导的影响

2.4 培养基不同无机盐浓度对胚状体诱导的影响

培养基中的无机盐浓度对胚状体的诱导影响很大。从表6可知，3个杂种F1代的未授粉子房在3种培养基上培养的表现趋势是一致的。当培养基中不另加无机盐（即M1）时，3个杂种F1代的未授粉子房接种后很快白化，约20 d后大部分褐化死亡，胚状体诱导率都较低，平均仅有7.88%。当培养基中的无机盐浓度额外增加60%（即M2）时，3个杂种F1代未授粉子房离体培养的情况均有明显好转。子房接种5 d后就开始膨胀，15 d后能膨胀到直径15 mm左右。胚状体诱导率平均达到90.28%。当培养基中的无机盐浓度加倍（即M3）时，3个杂种F1代未授粉子房接种5 d后均表现为膨胀，但10 d后部分子房褐化死亡，胚状体诱导率较培养基M2均有所下降，平均为65.82%。综上可见，HW培养基中的无机盐浓度额外增加60%有助于对胚状体的诱导。

此外，3个杂种F1代的未授粉子房在3种无机盐浓度不同的培养基上进行培养，胚状体诱导效果因未授粉子房供体材料不同而有所差异，K346× 6388 F1未授粉子房在不同培养基上的胚状体诱导率除M1培养基外均最高，平均诱导率也最高，达58.89%，而Coker371Gold×龙江911 F1未授粉子房在不同培养基上的胚状体诱导率均最低，平均为51.32%。

表6 不同无机盐浓度对胚状体诱导的影响

2.5 培养基不同外源激素配比对胚状体诱导的影响

培养基中外源激素种类和配比不同，对胚状体的诱导效果有很大差异。统计结果（表7）表明，在16种不同外源激素配比中，外源激素配比为IAA 0.5 mg/L、6-BA 2 mg/L和配比为KT 2.0 mg/L、2,4-D 0.5 mg/L的培养基诱导胚状体的效果最好，诱导率均几乎达到90%；其次是外源激素配比为IAA 0.5 mg/L、2,4-D 0.5 mg/L和配比为KT 2.0 mg/L、6-BA 2 mg/L，胚状体诱导率在85%左右；而外源激素配比为IAA 1.0 mg/L、2,4-D 1.0 mg/L，配比为IAA 1.0 mg/L、2,4-D 0.5 mg/L和配比为KT 2.0 mg/L、6-BA 1 mg/L的培养基诱导胚状体的效果最差，诱导率均不超过50%。可见，在用HW培养基对烟草未授粉子房进行离体培养时，培养基中以附加IAA 0.5 mg/L和6-BA 2 mg/L或者附加KT 2.0 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L为佳。

表 7 不同外源激素配比胚状体诱导的影响

2.6 不同琼脂浓度对胚状体诱导的影响

培养基中琼脂浓度不同对胚状体诱导也有影响。从表8中可知，培养基中琼脂浓度为7 g/L的情况下，子房玻璃化率达到90.00%，因而胚状体诱导率较低，仅有50.00%；随着琼脂浓度的增加，子房玻璃化现象逐渐减轻，胚状体诱导率逐渐提高，当琼脂浓度增加到9 g/L时，胚状体诱导率最高，达89.47%；但随着琼脂浓度增加到10 g/L时，子房玻璃化现象虽然大幅减轻，但有相当部分子房很快褐化死亡，胚状体诱导率反而下降到72.22%。综合考虑，培养基中的琼脂浓度应以9 g/L为宜。

表8 不同琼脂浓度对子房玻璃化的影响

3 讨 论

外植体的消毒影响着子房在培养过程中可能受污染的程度以及胚状体诱导率的高低。在本研究条件下，各种消毒方法均有较好的灭菌效果，但是剥开花瓣灭菌处理会致使胚状体诱导率下降，这说明灭菌处理溶液直接浸泡子房，可能会对子房的分化能力有一定的伤害。虽然升汞灭菌前先用酒精浸泡与不用酒精浸泡相比，对胚状体诱导率无太大影响，但增加了灭菌步骤和成本。可见，一种好的消毒方法应该步骤简单，既能有效灭掉外植体表面的杂菌，又不妨碍外植体的生长。

子房的接种包括接种方式和接种密度2个方面。祝仲纯等[9-11]、吴伯骥等[12]和潘莉等[13-14]采用烟草子房直接接种能够诱导出胚状体，但本研究采用子房直接接种，很少有胚状体产生，这主要是由于在培养过程中子房壁增厚，玻璃化严重，抑制了胚珠的发育。而去除子房壁后接种，则能观察到许多胚状体。这些结果与先前的研究[3]是一致的。本研究结果显示，去除子房壁并横切子房后接种，能获得较好的胚状体诱导效果，但若将子房切碎接种则胚状体诱导率下降，这可能是由于外植体受损严重，毒性酚类物质或其氧化物醌类物质在培养基中积累并抑制了其他酶的活性[15]，致使外植体褐化死亡而导致的。关于烟草子房培养中的密度效应迄今未见报道。在本研究中，子房接种密度由1块/瓶增加到2块/瓶，可能更有助于培养基的条件化，致使子房组织释放到培养基中的某些物质能够促进子房多细胞结构的形成，进而诱导胚状体的产生[16]。而当接种密度增加后，可能由于培养基营养供应不足，同时子房产生的有害次生代谢物增多，而致使子房褐化严重，胚状体诱导率下降[15]。

培养基是未授粉子房离体培养成败的关键。培养基中无机盐成分是植物生长发育所必需的。无论前人采用H培养基或HW培养基，无机盐成分及其浓度基本上没有变化[9-14]。而本研究采用无机盐浓度未改变的HW培养基时，很少有胚状体产生，这可能是无机盐营养不足所致。当增大培养基中无机盐浓度时，情况明显好转，这说明在HW培养基中，采用更高的无机盐浓度有利于对胚状体的诱导。但无机盐浓度额外增加到2倍时，胚状体诱导率下降，这主要是由于盐离子浓度过高而导致了部分子房褐化死亡[15]。培养基中添加外源激素在未授粉子房离体培养过程中也有利于胚状体诱导[1,7,13,17]。在烟草子房培养中，常用的外源激素包括生长素类激素IAA、2,4-D和细胞分裂素类激素6-BA和KT[9-14]。祝仲纯等[9-11]和吴伯骥等[12]采用IAA 0.5mg/L与KT 2 mg/L或KT 6 mg/L配合使用对烟草子房进行了离体培养。潘莉等[13]又探讨了2,4-D和6-BA的不同浓度配比对烟草子房培养的作用。为了进一步筛选培养基中附加的有助于提高胚状体诱导率的外源激素及其浓度，本研究在前人研究[9-14,17]的基础上，又另外探讨了IAA与6-BA，2,4-D与KT，以及IAA与2,4-D，KT与6-BA的不同浓度配比对子房培养的作用，结果显示，生长素类激素同类配合或者细胞分裂素类激素同类配合使用对胚状体的诱导效果总体上不如细胞分裂素类与生长素类激素的配合使用，这与前人的研究是一致的[7,9-14]。本研究中，IAA与6-BA以及2,4-D与KT采用适当的浓度配合使用，均有着较好的胚状体诱导效果。这进一步说明不同种类激素合理的浓度搭配，对胚状体的诱导是非常重要的[1,13,17]。培养基中的琼脂作为支持物，利于各种外植体的培养。在本研究中，随着琼脂浓度的增加，玻璃化程度逐渐减轻，但琼脂浓度过高时，胚状体诱导率反而下降。这可能是由于琼脂浓度低，使培养基内水势过高，造成培养器皿内空气湿度大，导致子房玻璃化，而增加琼脂浓度，能够降低培养基的水势，减少培养基中子房可获得的水分，因而可明显减轻子房的玻璃化现象[18]。但琼脂浓度过高时，会致使培养基太硬而不利于外植体吸收营养[18]，进而导致胚状体诱导率下降。

4 结 论

以不同的杂种F1代为试材，分别建立了烟草未授粉子房离体培养过程中的消毒方法、接种方式、接种密度、无机盐浓度、外源激素配比和琼脂浓度6个因素的最佳技术参数。在进行烟草未授粉子房的离体培养过程中，花蕾不剥开花瓣而直接采用0.1%升汞浸泡8 min进行消毒，再剥开子房壁将子房横切后接种，每个125 mL三角瓶中接种2块子房，培养基采用改良的H培养基额外增加60%无机盐，附加IAA 0.5 mg/L和6-BA 2 mg/L，或者附加KT 2 mg/L和2,4-D 0.5 mg/L，琼脂浓度9 g/L，能够获得较高的胚状体诱导率。

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Study on the Factors Influencing the Induction of Embryoids byCulture of Unpollinated Ovary in Tobacco

CAO Jinglin, WANG Xin, CHENG Junqi*, LI Yapei, WU Chenglin, ZHANG Junjie, CAI Changchun

(Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China)

The utilization value of female haploids derived from unpollinated ovaries is superior to male haploids derived from anthers or microspores in tobacco breeding. Therefore,culture of unpollinated ovary is of great significance for tobacco haploid breeding. In order to establish the technique system forculture of unpollinated ovaries, different F1 hybrids were used as test materials to explore the effects of six key factors, including disinfection method, inoculation method, inoculation density, inorganic salt concentration, exogenous hormone ratio, and agar concentration, on embryoid induction in HW media. The results showed that the measures that contributed to the induction of embryoids were as follows: the buds were immersed in 0.1% HG solution for 8 min without peeling the petals, the ovary walls were peeled off and the ovaries were transected before inoculation, 2 ovaries were inoculated in each 125 mL triangular flask, and the inorganic salt concentration in HW media was increased by an additional 60%, with additional IAA 0.5 mg/L and 6-BA 2 mg/L, or KT 2.0 mg/L and 2,4-D 0.5 mg/L, and agar concentration of 9 g/L. Based on this, the technical parameters forculture of unpollinated tobacco ovaries were further improved.

tobacco; unpollinated ovary;culture; embryoid; influencing factor

S572.01

A

1007-5119(2023)06-0084-07

中国烟草总公司湖北省公司科技重点项目（027Y2022-021）

曹景林（1967-），男，博士，副研究员，主要从事烟草育种研究。E-mail：caojinglin670425@sohu.com。*通信作者，E-mail：424653@qq.com

2023-07-06

2023-11-01

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.012