微酸性电解水对产气荚膜梭菌芽孢的杀灭效果及作用机制

林婷婷 孙芝兰 刘芳 吴海虹 张春红 王道营

林婷婷，孫芝兰，刘  芳，等. 微酸性电解水对产气荚膜梭菌芽孢的杀灭效果及作用机制［J］. 江苏农业学报，2023，39（8）：1755-1761.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2023.08.016

收稿日期：2022-10-18

基金项目：江苏省农业科技自主创新基金项目[CX（22）2044]

作者简介：林婷婷（1996-），女，河南信阳人，硕士研究生，研究方向为食品微生物。（E-mail）Ltt9625@163.com

通讯作者：吴海虹，（E-mail） 305087638@qq.com；张春红， （E-mail）zhangchsy@163.com

摘要：微酸性电解水（SAEW）是一种安全有效的新型杀菌剂。本研究分析了SAEW对产气荚膜梭菌芽孢的杀灭效果，并研究了其杀灭芽孢的作用机制。结果显示，10 mg/L、20 mg/L和30 mg/L SAEW处理30 min后产气荚膜梭菌芽孢存活数明显降低，SAEW杀灭效果明显。并且40 mg/L SAEW处理5 min就可以完全灭活芽孢。扫描电子显微镜观察结果表明，质量浓度为40 mg/L SAEW处理可使芽孢干瘪皱缩，失去原本饱满的芽孢形态。激光共聚焦显微镜观察结果显示，与对照组相比，40 mg/L SAEW处理过的芽孢均呈现红色，说明芽孢的外膜被SAEW破坏，并且芽孢全部死亡。相同处理时间，随着SAEW质量浓度的不断提高，芽孢的疏水性不断降低， Zeta-电位绝对值和粒径不断变小，并且芽孢内核物质DPA大量释放，这说明SAEW处理破坏了芽孢的内膜结构。因此，SEAM可通过破坏芽孢的内膜结构及外层结构达到杀灭效果。

关键词：微酸性电解水；产气荚膜梭菌；芽孢

中图分类号：TS201.6      文献标识码：A      文章编号：1000-4440（2023）08-1755-07

Bactericidal effect and mechanism of action of slightly acidic electrolyzed water on Clostridium perfringens spores

LIN Ting-ting1，2 SUN Zhi-lan2 LIU Fang2 WU Hai-hong1 ZHANG Chun-hong1 WANG Dao-ying1，2

（1.College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China;2.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract：Slightly acidic electrolyzed water （SAEW） is a new safe and effective bactericide. In this study， the bactericidal effect of SAEW on Clostridium perfringens spores was analyzed， and the mechanism of its action in killing the spores was studied. The results showed that the survival number of Clostridium perfringens spores decreased significantly after 30 minutes of treatment with 10 mg/L， 20 mg/L， and 30 mg/L SAEW， indicating a significant bactericidal effect. Moreover， the C. perfringens spores were completely inactivated after treatment with 40 mg/L SAEW for 5 min. Scanning electron microscopy results showed that treatment with 40 mg/L SAEW could make the spores shrivel and shrink. Confocal laser scanning microscopy showed that all the SAEW-treated spores at 40 mg/L showed red color compared with the control group， indicating that the outer membrane of the spores was destroyed by SAEW， and all the spores died. With the increasing of SAEW concentration， the hydrophobicity of spores decreased， the absolute value of zeta-potential and particle size became smaller， and the spore core substance DPA was released more and more， which indicated that SAEW treatment disrupted the inner membrane structure of the spores. Therefore， SAEM can achieve bactericidal effect by disrupting the inner membrane structure and outer structure of spores.

Key words：slightly acidic electrolyzed water;Clostridium perfringens;spores

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种可产芽孢、形成生物被膜的革兰氏阳性条件致病菌，普遍存在于自然环境中，尤其是存在于人和动物肠道内以及土壤中[1]。该菌有分解动植物体内大部分糖分的能力，并且产生气体和毒素，因此称为产气荚膜梭菌[2]。该菌体积较大，呈杆状，其芽孢经常位于菌体两端，对于特殊条件的抵抗力，芽孢比营养体更强。产气荚膜梭菌可形成芽孢，芽孢内部含水量极低，条件不适宜时，会形成休眠体，且休眠体对外界环境的改变抵抗性极强[3]。待到外界环境适宜时，芽孢便会萌发，此时就会污染所处的环境，由于芽孢致病性极强，因此常常造成巨大的经济损失[4]。据统计，每年因为产气荚膜梭菌导致的坏死性肠炎给全球畜禽业造成的经济损失高达2.0×109美元[5]。高温、强酸、强碱、高压等条件都不足以灭活芽孢，所以普通杀菌条件并不能杀死芽孢，因此可以选择协同灭菌方法去灭活芽孢。

微酸性电解水（Slight acidic electrolyzed water，SAEW）是指pH为5.0～6.5、有效氯质量浓度为10～90 mg/L的电解水[6]。SAEW具有杀菌范围广、杀菌效果显著、对人体和环境无害、获取方法简便等众多优势，所以被用于食品、农业、医疗等领域[7]。研究结果显示，SAEW对水产品表面的有害菌例如单增李斯特菌具有良好的灭活作用[8]。Okanda等[9]利用SAEW对生菜进行冲洗和浸泡处理，结果显示其有较好的杀菌效果。刘如霆等[10]研究SAEW对净化太平洋牡蛎的杀菌效果，与未经SAEW处理的对照组太平洋牡蛎相比，经过SAEW处理的太平洋牡蛎的菌落总数显著降低，并且在之后的暂养过程中也呈现良好的抑菌效果。

产气荚膜梭菌在现实生活中严重影响食品安全，由于其污染的范围广、污染种类多、污染途径多，并且其产生的毒素对人类和畜禽都有巨大的毒性。因此控制与消除产气荚膜梭菌污染对保证食品安全至关重要。本试验主要研究不同质量浓度的SAEW对产气荚膜梭菌芽孢的杀灭效果，并探索了SAEW对产气荚膜梭菌芽孢的灭活机制，为食品和其他领域提供一种新的灭活产气荚膜梭菌芽孢的思路。

1  材料与方法

1.1  产气荚膜梭菌芽孢的制备

产气荚膜梭菌C1是从实验室购买的生鸡中获取的，并通过16S rRNA测序确定其准确性。将产气荚膜梭菌C1接入到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤培养基（TPGY）中，放入厌氧罐厌氧培养24 h。参考Juneja等[11]的方法，将上述培养基里的0.1 ml产气荚膜梭菌C1菌液接入新鲜制备的10 ml液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）中，75 ℃水浴激活20 min，冷却后放入厌氧罐厌氧培养18 h。再从刚才培养的FTG中吸取1 ml接入新1支液体硫乙醇酸盐培养基中，厭氧培养4 h，之后再重复上述步骤1次。然后将FTG中的菌体接入新鲜制备的邓肯（Duncan strong，DS）强培养基中。放入厌氧罐厌氧培养3 d。将培养好的产气荚膜梭菌芽孢进行离心，4 ℃下10 000 g 离心10 min，反复离心3次。将离心好的芽孢保存在无菌水中并存放在4 ℃冰箱中。用光学显微镜计数来测定孢子的含量。首先，取10 ml培养液到载玻片上涂抹、干燥并固定，然后加入3～5滴孔雀绿染色液，加热染色液使其变热，但不煮沸，在染色溶液出现热蒸汽4～5 min后，倒出染色溶液并洗涤，之后在光学显微镜下观察孢子。

1.2  微酸性电解水（SAEW）的制备与试验设计

SAEW是利用一个电解水装置（HD-240L，上海旺普贸易有限公司产品）制备的，制备的SAEW质量浓度分别为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和40 mg/L。采用Seven Mult pH计对SAEW的pH值进行测定，利用碘量法测定其有效氯浓度。将培养好的产气荚膜梭菌芽孢和不同质量浓度的SAEW等量混合处理5 min、15 min、30 min。产气荚膜梭菌芽孢的初始含量在1×105  CFU/ml左右，加入SAEW后芽孢的含量为1×104  CFU/ml左右。SAEW处理之后，进行梯度稀释，吸取等量的菌液接入FTG中进行厌氧培养，如在FTG中澄清透明说明芽孢被完全灭活，如在平板上未形成菌落，FTG中有絮状物和气泡产生，则低于检测限以下。

1.3  产气荚膜梭菌芽孢形态变化观察

使用扫描电子显微镜对经过SAEW处理的产气荚膜梭菌芽孢形态变化进行观察。参考前人的方法[12]，通过离心（6 000 r/min、10 min、4 ℃）收集经过SAEW处理的产气荚膜梭菌的芽孢，使用0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3次。然后，加入1 ml 2.5%戊二醛溶液，芽孢在4 ℃下固定12 h，随后在不同体积分数（50%、70%、80%、90%）的乙醇中脱水，每个梯度10 min，最后用100%无水乙醇脱水3次，每次30 min。将脱水之后的芽孢悬浮于乙醇，吸取一定量到载玻片上并风干[12]。将处理后的芽孢固定在金属载板上，然后进行喷金处理。制备后，用扫描电镜观察不同质量浓度SAEW对产气荚膜梭菌芽孢的表面形态的影响。

1.4  激光共聚焦显微镜观察芽孢通透性

产气荚膜梭菌芽孢经过方法1.2处理后，参考Liu[13]的方法，将芽孢以6 000 r/min离心10 min，离心温度为4 ℃。加入0.1 mol/L PBS，用LIVE/DEAD BacLightTM活力试剂盒避光染色30 min，之后，将样品以6 000 r/min离心3次，每次5 min，离心温度设置为4 ℃。最后加入0.1 mol/L PBS并混合均匀，用Leica Ultra View VOX共聚焦激光扫描显微镜观察芽孢的通透性。

1.5  2，6-吡啶二羧酸（DPA）释放率测定

参考Alistair等[14]的方法并进行适当修改，用荧光分光光度计测定芽孢上清液荧光强度。根据方法1.2中的方法利用不同质量浓度的SAEW对芽孢进行试验处理，在10 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液。同时在100 ℃下分别准备相同含量的芽孢进行水浴1 h，测定的2，6-吡啶二羧酸作为芽孢总2，6-吡啶二羧酸（DPA）含量。激发波长为270 nm，发射波长为545 nm。通过以下公式计算DPA释放率：

DPA含量=Fd/Fi×100%

式中DPA含量是初始DPA的含量，Fd是对照组产气荚膜梭菌芽孢释放的DPA的含量，Fi为不同SAEW处理组产气荚膜梭菌芽孢中DPA的含量。

1.6  芽孢粒径和Zeta-电位的测定

参考Lyu等[15]和Chen等[16]的方法并进行修改，对芽孢进行不同质量浓度的SAEW处理之后，采用Nano-ZS粒径分析仪对芽孢进行粒径和Zeta-电位测量。测定之前开机进行自动调节参数，加样量超过容器体积的3/4，每次换样前都用清水清理仪器，以蒸馏水作为空白对照。

1.7  疏水性的测定

根据Lyu[15]和Noma等[17]的研究方法并稍作修改，首先对未处理和处理后的芽孢悬浮液进行测定，其在600 nm处的光度值记作A0，取3.0 ml芽孢悬浮液加入0.5 ml正十六烷涡旋混合，室温下静置15 min，测定其上清液在600 nm处光度值记作Af，芽孢疏水性（RSH）按照以下公式进行计算：

RSH=（A0-Af）/A0×100%

1.8  数据处理及分析

采用Origin2019作图，本试验的所有处理均重复3次，数据用平均值和标准差计算。使用SPSS软件通过单向方差分析（ANOVA）和LSD检验进行统计分析，其中组间显著性水平为P<0.05。

2  结果与分析

2.1  产气荚膜梭菌芽孢的灭活

为观察不同质量浓度SAEW处理对产气荚膜梭菌芽孢的作用效果，本试验选取10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的SAEW分别处理产气荚膜梭菌5 min、15 min、30 min，比较不同质量浓度SAEW处理下产气荚膜梭菌芽孢的失活情况。由图1可知，微酸性电解水质量浓度越大，芽孢失活越明显。当SAEW处理质量浓度为10 mg/L，处理5 min、15 min芽孢的失活效果没有明显区别，芽孢最大失活量为4.31×104  CFU/ml；当SAEW质量浓度为20 mg/L，处理5 min芽孢的失活量为5.74×104  CFU/ml，处理15 min芽孢的失活量为5.82×104  CFU/ml，当处理时间延长到30 min，芽孢的失活量为5.92×104  CFU/ml。结果显示，当微酸性电解水质量浓度為20 mg/L时，随着处理时间的延长，微酸性电解水处理灭活芽孢效果显著提高；当SAEW质量浓度为30 mg/L，处理时间为5 min，芽孢的失活量为5.97×104  CFU/ml，当处理时间延长至15 min和30 min，芽孢的失活量为6.02×104  CFU/ml和6.03×104  CFU/ml。芽孢失活量与SAEW的质量浓度有关，与处理时间的关系紧密且随着时间的变化而变化；当SAEW质量浓度为40 mg/L时，芽孢在5 min内就全部失活，证明随着微酸性电解水处理时间的延长和微酸性电解水质量浓度提高，杀灭产气荚膜梭菌芽孢的效果越好。由以上结果得知，随着微酸性电解水质量浓度增加，微酸性电解水对产气荚膜梭菌芽孢的杀灭效果越强，这一结果与Ni等[18]的研究结果相似。Han等[19]通过用有效氯质量浓度为20～80 mg/L的微酸性电解水，1～7 min的处理时间单独处理生菜，可使生菜上的沙门氏菌减少一半的数量。Issa-Zacharia等[20]采用有效氯质量浓度为21～22 mg/L的SAEW对新鲜即食蔬菜和芽苗菜处理15 min，并与用次氯酸钠处理的进行比较，结果显示SAEW处理比次氯酸钠处理显著（P＜0.05）降低了芹菜、生菜和大白菜芽中大肠杆菌和沙门氏菌的数量。

图柱上不同小写字母表示处理间差异达0.05显著水平。

2.2  芽孢形态

不同质量浓度的SAEW处理后，产气荚膜梭菌芽孢的表观结构变化见如图2。图2A显示，未处理的芽孢表面光滑圆润，没有任何的破损和褶皱。图2B呈现的是20 mg/L SAEW处理30 min后产气荚膜梭菌芽孢的状态，芽孢表面仍未有明显变化，说明此时的芽孢仍未受到严重伤害。图2C显示的是产气荚膜梭菌芽孢经过40 mg/L SAEW处理30 min后的形态。与对照组相比，40 mg/L SAEW处理30 min后芽孢形态发生明显变化，芽孢表面出现褶皱，芽孢外膜受到破坏，表明SAEW对产气荚膜梭菌芽孢的外膜有破坏作用。梁铎[21]在微酸性电解水对李斯特菌进行抑菌作用的研究中发现，对照组李斯特菌菌体完整，表面光滑，而经过SAEW处理的李斯特菌表面出现褶皱，菌体变形，菌体内容物也出现泄露。

2.3  芽孢通透性

采用激光共聚焦显微镜分析不同质量浓度SAEW处理产气荚膜梭菌芽孢后细胞膜渗透性的变化（图3）。对照组的芽孢整体呈绿色（图3A），这说明此时芽孢处于存活状态。经过20 mg/L SAEW处理30 min后，有小部分芽孢呈现橙红色，但大部分还是处于绿色（图3B），这说明此时的芽孢有小部分处于死亡状态。经过40 mg/L SAEW处理30 min后，大部分芽孢转变成红色（图3C），可以看出芽孢此时大部分已经死亡。这一结果也与SAEW处理其他菌的结果相似，如Liu等[22]用30 mg/L SAEW杀灭克雷伯菌，在激光共聚焦显微镜下可以观察到30 mg/L SAEW处理下，克雷伯菌大部分都变成了红色，此时菌体处于被灭活状态。

2.4  2，6-吡啶二羧酸释放率

2，6-吡啶二羧酸（DPA）是细菌芽孢内核特有的物质，当芽孢萌发或内核结构完整性受到破坏时，DPA就被释放出来[23-24]。不同质量浓度SAEW处理产气荚膜梭菌芽孢后其结构变化如图4所示，未处理的芽孢（对照）结构较完整，不能释放DPA，经过10 mg/L SAEW处理15 min后，芽孢DPA释放率与对照组相比显著增加。经过20 mg/L和30 mg/L SAEW处理后，尤其是40 mg/L SAEW处理后，导致芽孢内DPA大量释放。从图4可知，随着SAEW质量浓度的增加，DPA的释放量也呈现不断上升的趋势（P＜0.05）。说明，微酸性电解水可能通过扩散作用穿透芽孢外衣，破坏芽孢内膜，导致芽孢内特有物质DPA大量释放。Fan等[25]研究发现被超声联合热处理杀死的孢子在随后的热处理中比未处理的孢子更容易释放DPA。

图柱上不同小写字母表示处理间差异达0.05显著水平。

2.5  粒径和Zeta-电位

不同质量浓度SAEW对产气荚膜梭菌芽孢的Zeta-电位的影响如图5A所示，未经处理的芽孢Zeta-电位的绝对值最高，经过不同质量浓度的SEAW处理后，Zeta-电位的绝对值出现下降的趋势。可能是在微酸性电解水处理过程中芽孢外层结构受到破坏，因此芽孢的Zeta-电位下降[17]。Zeta-电位的绝对值降低，可能是因为微酸性电解水通过扩散作用穿过芽孢外膜进入芽孢内部，使芽孢结构蛋白质发生变性，从而导致芽孢电位的绝对值降低[26]。Lyu等[15]研究发现，蜡样芽孢的Zeta-电位值在未处理和处理过的样品中均为负值。且随着超声波处理时间的增加而降低，这说明超声波处理破坏了芽孢的外层结构。

不同质量浓度SAEW对芽孢粒径的影响如图5B所示，与对照组相比，经过不同质量浓度SAEW处理的芽孢粒径变小，尤其是40 mg/L SAEW处理。经过10 mg/L SAEW处理5 min后，芽孢粒径与对照组相比显著缩小。20 mg/L SAEW处理，随着处理时间的延长，芽孢粒径逐渐缩小（P＜0.05）。经过30 mg/L SAEW处理后，芽孢的粒径比10 mg/L和20 mg/L SAEW处理缩小更加明显。用40 mg/L SEAW处理后，芽孢的粒径达到最小，这与芽孢残存数是一致的。图5B显示，相同处理时间，随着SAEW质量浓度的增加，芽孢的粒径呈现不断下降的趋势，这可能是因为芽孢被SAEW破坏了外层结构，因此芽孢粒径减小。樊丽华[27]的研究结果显示，在超声波处理芽孢过程中，芽孢粒径变小，这可能是由于芽孢外层蛋白质在超声波处理中遭到破坏，从而导致芽孢粒径减小。

2.6  疏水性

如图6所示，相同处理时间，随着SAEW处理质量浓度的升高，芽孢的疏水性总体上呈现下降的趋势。在10 mg/L SAEW处理下，芽孢疏水性变化不明显；在30 mg/L SAEW处理下，芽孢疏水性出现明显下降趋势。在40 mg/L SAEW处理下，芽孢疏水性较对照显著下降，但不随处理时间变化而变化。这说明SAEW处理芽孢会破坏芽孢外层结构蛋白质，引起芽孢结构发生不可逆改变进而影响芽孢疏水性。据报道，SAEW（有效氯质量浓度为25.27 mg/L）会破坏大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的细胞膜[28]。研究结果显示，这可能是由于SAEW中的有效成分通过芽孢外膜进入芽孢导致内部成分失活，芽孢自身抗性下降[29]。

图柱上不同小写字母表示处理间差异达0.05显著水平。

图柱上不同小写字母表示处理间差异达0.05显著水平。

3  结  论

SAEW处理质量浓度的不断增加可以有效缩短产气荚膜梭菌芽孢失活时间，破坏芽孢外层蛋白质中氨基酸带电荷量，从而导致芽孢Zeta-电位绝对值降低，粒径下降，疏水性也隨之下降，导致芽孢内物质DPA大量释放，由此可知SAEW处理能使芽孢的内核结构崩溃。在扫描电镜下观察，可以明显看到在SAEW处理质量浓度为40 mg/L时芽孢的状态，芽孢整体结构遭到破坏，芽孢的表面变得粗糙甚至变形。SAEW的杀灭效果与其自身的质量浓度及处理时间有关，在使用时，可根据不同食品类型的特点来确定。本研究结果为灭活产气荚膜梭菌芽孢提供了一定的科学依据，也为在那些不能高温灭菌的食品上灭活芽孢提供了新方法。

参考文献：

[1]  ROOD J I， COLE S T. Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens[J]. Microbiol Rev，1991，55（4）：621-648.

[2]CARMAN R J， SAYEED S， LI J H， et al. Clostridium perfringens toxin genotypes in the feces of healthy North Americans [J]. Anaerobe，2008，14（2）：102-108.

[3]CHRISTIE G， SETLOW P. Bacillus spore germination：knowns unknowns and what we need to learn [J]. Cellular Signalling，2020，74：109729.

[4]RAHAYU W P， FARDIAZ D， KARTIKA G D， et al. Estimation of economic loss due to food poisoning outbreaks [J]. Food Science and Biotechnology，2016，25（5）：157-161.

[5]胡  均，張克英，白世平，等. 枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌攻毒肉鸡生长性能和肠道健康的影响[J]. 动物营养学报，2019，31（5）：2127-2135.

[6]蓝蔚青，刘  琳，孙晓红，等. 酸性电解水发生机理及在水产领域中的应用研究进展[J]. 食品与发酵工业，2020，46（4）：294-298.

[7]唐志龙，ALERYANI H，高  晴，等. 微酸性电解水凝胶对天麻鲜切片贮藏品质的影响[J]. 食品安全质量检测学报，2022，13（8）：2625-2632.

[8]梁  凡，杜  明，潘迎捷，等. 酸性电解水对低温条件下单增李斯特菌杀灭效果[J]. 上海海洋大学学报，2022，31（6）：1570-1581.

[9]OKANDA T， TAKAHASHI R， EHARA T， et al. Slightly acidic electrolyzed water disrupts biofilms and effectively disinfects Pseudomonas aeruginosa [J]. Journal of Infection and Chemotherapy，2019，25（6）：452-457.

[10]刘如霆，李紫薇，马  磊，等. 微酸性电解水对净化太平洋牡蛎杀菌效果与品质和生理活性的影响[J]. 食品科技，2022，47（3）：125-133.

[11]JUNEJA V K， CALL J E， MARMER B S， et al. The effect of temperature abuse on Clostridium perfringens in cooked turkey stored under air and vacuum [J]. Food Microbiology，1994，11（3）：187-193.

[12]LUO W， WANG J Q， WANG Y， et al. Bacteriostatic effects of high-intensity ultrasonic treatment on bacillus subtilis vegetative cells [J]. Ultrasonics Sonochemistry，2021，81：105862.

[13]LIU F， WANG F T， DU L H， et al. Antibacterial and antibiofilm activity of phenyllactic acid against Enterobacter cloacae [J]. Food Control，2018，84：442-448.

[14] ALISTAIR A， HINDLE， ELIZABETH A， et al. Dipicolinic acid （DPA） assay revisited and appraised for spore detection [J]. The Analyst，1999，124（11）：1599-1604.

[15]LYU R， ZOU M M， CHEN W J， et al. Ultrasound： enhance the detachment of exosporium and decrease the hydrophobicity of Bacillus cereus spores [J]. LWT-Food Science and Technology，2019，116：108473.

[16]CHEN W J， ZOU M M， MA X B， et al. Co-encapsulation of EGCG and quercetin in liposomes for optimum antioxidant activity [J]. Journal of Food Science，2019，84（1）：111-120.

[17]NOMA S， KIYOHARA K， HIROKADO R， et al. Increase in hydrophobicity of Bacillus subtilis spores by heat， hydrostatic pressure， and pressurized carbon dioxide treatments [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2018，125（3）：327-332.

[18]NI L，ZHENG W C， QIANG C， et al. Application of slightly acidic electrolyzed water for decontamination of stainless steel surfaces in animal transport vehicles [J].Preventive Veterinary Medicine，2016，133：42-51.

[19]HAN R W，LIAO X Y ， AI C M， et al. Sequential treatment with slightly acidic electrolyzed water （SAEW） and UVC light-emitting diodes （UVC-leds） for decontamination of Salmonella typhimurium on lettuce [J]. Food Control，2020，123（6）：107738.

[20]ISSA-ZACHARIA A， KAMITANI Y， MIWA N， et al. Application of slightly acidic electrolyzed water as a potential non-thermal food sanitizer for decontamination of fresh ready-to-eat vegetables and sprouts [J]. Food Control，2011，22（3/4）：601-607.

[21]梁  铎. 微酸性电解水对单增李斯特菌的杀菌机制及应用研究[D]. 石家庄：河北科技大学，2019.

[22]LIU F， TANG C， WANG D B， et al. The synergistic effects of phenyllactic acid and slightly acid electrolyzed water to effectively inactivate Klebsiella oxytoca planktonic and biofilm cells [J]. Food Control，2020，125（20）：107804.

[23]DING T， XUAN X T， LI J， et al. Disinfection efficacy and mechanism of slightly acidic electrolyzed water on Staphylococcus aureus in pure culture [J]. Food Control，2016，60：505-510.

[24]王一曉. 热和化学物质最佳诱导枯草杆菌芽孢萌发条件的研究[D]. 银川：宁夏大学，2016.

[25]FAN L H， ISMAIL B B， HOU F R， et al. Thermosonication damages the inner membrane of Bacillus subtilis spores and impels their inactivation [J]. Food Research International，2019，125：108514.

[26]刘文光，李云芝，孙福强，等. 含氯消毒剂的碘量法分析[J]. 中国蚕业，2005（1）：47-48.

[27]樊丽华. 超声波协同热失活Bacillus_subtilis芽孢的机制研究 [D]. 杭州：浙江大学，2021.

[28]HAO J X， WU T J， LI H J， et al. Differences of bactericidal efficacy on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， and Bacillus subtilis of slightly and strongly acidic electrolyzed water [J]. Food & Bioprocess Technology，2016，10（1）：155-164.

[29]HAO J X， QIU S， LI H Y， et al. Roles of hydroxyl radicals in electrolyzed oxidizing water （EOW） for the inactivation of Escherichia coli [J]. International Journal of Food Microbiology，2012，155（3）：99-104.

（责任编辑：陈海霞）