破坏细菌芽孢高抵抗力的研究进展

黄筱钧，徐 慧，白游震，徐志豪

湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000)

芽孢是细菌的特殊结构，细菌的芽孢对热、干燥、辐射、化学消毒剂及抗菌药物具有极强的抗性，芽孢是否被破坏是判断灭菌效果的指标。芽孢的高抵抗力与其结构、化学组成等有关。细菌的芽孢是某些外源性感染的重要来源，破伤风、气性坏疽、炭疽病等都是有芽孢的细菌感染引起的。煮沸、高压蒸汽灭菌、高静压、高压二氧化碳是破坏芽孢的常用方法，但这些方法有的对设备要求高，有的需要处理较长时间，有的不能连续处理。本文通过剖析芽孢高抵抗力的基础，总结现有破坏芽孢的方法及机制，提出了我们对破坏芽孢可能性的思考，以期为探索出稳定、高效、易操作的破坏细菌芽孢的方法提供理论基础。

1 芽孢高抵抗力的基础

芽孢的形成受细菌染色体DNA中芽孢合成相关基因的控制，与其结构、2,6-吡啶二羧酸钙盐(Calcium 2,6-pyridyl-dicarboxylate，DPA-Ca)、α/β小分子酸溶性蛋白(Small acid-soluble proteins，SASP)等化学组成有关。

1.1结构学说芽孢由内向外依次为核心、内膜、芽孢壁、皮质、外膜、芽孢壳和芽孢外衣，具有多层膜结构[1-2]。多层膜结构是芽孢高抵抗力的基础，其共同特点是含水量低、酶活性差。芽孢外衣是形成芽孢后细菌母细胞的膜残留物，它是芽孢抵御外界环境干扰的第一道屏障；芽孢壳致密而无通透性，对大多数蛋白酶、溶菌酶以及表面活性剂具有强的抵抗作用；外膜对维持芽孢内外平衡有一定的作用；皮质主要由肽聚糖组成，结构疏松，能有效保持核心的低水分状态，对维持芽孢抗性极为重要；芽孢壁也由肽聚糖组成，其主要作用是在萌发后形成细胞壁；内膜通透性低，可阻止化学药物进入核心[3-5]。

1.2化学学说核心区包含芽孢的遗传物质、酶系统、蛋白质合成系统。芽孢含水量低，菌体蛋白在热力作用下，不易变性。芽孢形成过程中能合成一些特殊的酶，这些酶具有很强的耐热性。此外，还有两种能提高芽孢抵抗力的特殊成分：DPA-Ca、SASP。DPA-Ca提高芽孢抵抗力的可能原因：①细菌在不利环境中，通过基因调控，生成大量赖氨酸生物合成通路的中间产物——DPA[6]。细菌一方面大量吸收外界环境中的Ca2+，另一方面抑制Ca2+流出，大量DPA与Ca2+在细菌内形成螯合物——DPA-Ca，DPA-Ca能降低芽孢核心区的水分，通过保护细菌蛋白质及其DNA，提高芽孢对外界的抵抗力[7]。②DPA由一个吡啶环和两个羧基构成，羧基上的氢原子被钙离子取代形成DPA-Ca螯合物。DPA及DPA-Ca中存在水分子，它与吡啶环中的氮原子和羧基中的C=O形成氢键，水中氧原子与DPA中的O—H也会形成氢键，因此分子间的相互作用很强，使得芽孢的热稳定性提高[8]。③DPA-Ca在芽孢内常以晶体的形式存在，相当于一个“库存”，热环境中，在解离酶作用下，解离成DPA与Ca2+，DPA与芽孢中的蛋白质结合，改变其构型，从而增强热稳定性[9]。④在芽孢中，Ca2+既是酶的激活剂又是多种耐热酶的热稳定剂，Ca2+在解离酶作用于DPA-Ca时被释放，同时促进解离作用。除此之外，Ca2+作用于芽孢膜时，能降低膜的通透性，稳定芽孢膜；作用于蛋白质时，可以稳定蛋白质结构，从而增强芽孢的抵抗力[10]。SASP与DNA结合后使DNA结构和光化学性质改变，提高芽孢对紫外线辐射的耐受力[11]。田晶晶等[12]研究发现凝结芽孢杆菌的芽孢形成具有环境pH值依赖性，中性偏碱的环境有利于芽孢化启动相关基因的转录，添加适量的碳酸钙，能促进芽孢形成。

1.3渗透调节皮层膨胀学说皮质层位于外膜和芽孢壁之间，外膜相当于一层屏障，对水和阳离子的通透性较差，而且皮质层含有大量带有负电荷的肽聚糖，由于异种电荷相互吸引，核心区的低价阳离子进入皮质层，使得皮质层的渗透压升高，通过渗透压差的作用吸收核心内部的水分。又因为水的比热容大，在外界温度发生变化时，能抵御部分外界传递的热量，具有一定的抵抗性。另一方面，由于DPA-Ca和蛋白质等大分子化合物束缚了皮质层中的水分，使自由水与结合水的比值大幅度降低，保持了核心区低水分的状态，从而导致酶活性降低，达到维持芽孢正常生理微环境的目的[13]。

2 破坏芽孢的方法

芽孢对物理、化学和生物因素具有强大的抵抗力，是芽孢在食品安全和医疗卫生等领域造成危害的基础。破坏芽孢的方法可分为物理方法和化学方法。

2.1物理方法在不改变芽孢分子结构的基础上，运用高温、高压或二者结合等物理方法可以达到降低芽孢抵抗力的目的。刘东红等[14]利用超声波与高压同时作用于芽孢，发现与单用比较，DPA的释放率更高，DPA的大量丢失降低了其对芽孢的保护作用，从而降低芽孢热抗性。Schottroff F等[15]实验发现热处理能提高芽孢对电场的敏感性，电场也能提高芽孢对热处理的敏感性，电场和热处理联合可以加强对枯草芽孢杆菌野生型(PS533)芽孢的灭活作用。研究发现，CO2(20MPa)和高温(84～86℃)联合作用可以破坏枯草芽孢杆菌芽孢的内膜，阻断芽孢萌发后的生长，间接起到破坏芽孢的作用[16-17]。章中等[10]使用化学萌发诱导剂诱导芽孢萌发，发现单独使用DPA诱导剂时芽孢萌发率最高(约95%)，萌发后芽孢内部结构发生改变，成为类似营养体的结构，此时细菌失去高抵抗力，继而在超高压作用下，这种结构会受到严重破坏，达到杀灭芽孢的目的。萌发的芽孢通过超高压处理后全部死亡，说明诱导芽孢萌发再结合超高压灭菌能有效杀灭芽孢。

2.2化学方法化学方法改变芽孢分子结构也可以达到降低芽孢抵抗力的目的。霍春芳等[18]发现稀土离子与Ca2+半径相近，可取代DPA-Ca上Ca2+的结合位点，与DPA形成更稳定的配合物。与此同时，芽孢内大量的Ca2+顺浓度梯度渗透出菌体，降低其抗性及活性，达到抑菌的效果，甚至可以杀灭细菌。邓小虹等[19]利用多种化学消毒剂(3 000 mg/L氯氧三嗪、100 mg/L二氧化氯、2%碱性戊二醛、环氧乙烷)处理手机，实验结果显示采用化学消毒剂浸泡方式处理难以达到理想的灭菌效果，相对而言，环氧乙烷灭菌效果更好，但需要专业的设备，所以该方法存在局限性。董蓉等[20]发现在强碱的胁迫下，芽孢多层膜结构受损，强碱进入芽孢内部破坏核酸和蛋白质等结构，同时造成芽孢膜通道受损，导致芽孢释放出DPA-Ca，最终造成芽孢耐受性下降。Kumar M等[21]以嗜热脂肪芽孢杆菌为实验对象，研究发现磷酸盐可以加速芽孢中Ca2+的流失，降低芽孢的耐热性，此方法可用于乳制产品的防腐。黄现青等[22]研究发现Surfactin可破坏芽孢壁的完整性、与DNA结合，从而灭活蜡样芽孢杆菌的芽孢。Abraham JP等[23]利用体外实验检测天然黄酮类苷、黄芩苷对艰难梭菌毒素合成、产孢及芽孢萌发的作用，结果显示黄芩苷的亚抑制浓度可以作用于产孢相关基因(spo0A、spoIIR、si-gH、spoIIA、spoIIID、CD2494)，影响芽孢的生成，还能抑制芽孢的生长。王涛等[6]诱导枯草芽孢杆菌成为L 型并传代培养获得稳定L 型纯培养物，研究显示枯草芽孢杆菌稳定L 型不再形成芽孢。

3 破坏芽孢的可能机制

破坏芽孢可以从破坏其本身的热稳定性出发，还可以从诱导芽孢萌发方面着手，降低其抵抗力；阻止芽孢萌发，使细菌长时间处于休眠状态，阻断细菌的生长繁殖；同时，从基因角度破坏芽孢也是值得关注的方向。

3.1破坏芽孢的热稳定性目前，氮酮在医药、化妆品、农业等行业有很高的使用率，得益于其促渗透作用。作为高效促渗透剂，氮酮除了对细菌繁殖体有抑菌作用外，对厌氧芽孢杆菌属的芽孢也具有抑制作用，常温下氮酮可以明显提高芽孢的渗透性。研究发现，氮酮与乙醇共同作用芽孢比单独使用乙醇效果更好[24-25]。因此，这种不需要高温和高压等严格条件，通过氮酮增加脂质的流动性，促进破坏DPA-Ca的物质进入芽孢，是降低芽孢热稳定性的基础。

芽孢中加入DPA后，能够诱导其萌发，萌发率可达到95%。此时芽孢的内部结构变成了类似营养体的结构，在这个过程中DPA-Ca转变成DPA和Ca2+[10]。DPA中的羧基在一定条件下可以与乙醇中的羟基发生酯化反应，生成酯类和水。在反应过程中加入干燥剂等物质使水减少，DPA的消耗因此增加，当维持芽孢热稳定性的DPA减少时，芽孢的热稳定性会降低，但此过程对反应的条件要求高。

芽孢中的DPA-Ca是配合物，稀土离子与Ca2+半径相近，稀土离子与氧、氮、硫的配位能力大于Ca2+。在Ca2+与有机配体通过氧、氨、硫形成的配合物中，稀土离子易于取代Ca2+的结合位点，使Ca2+流出芽孢，失去提高热稳定性的作用。还可以用其他形成配位键比Ca2+强的Cu2+等取代Ca2+，从而与DPA生成新的物质，使解离酶无法发挥作用，DPA失去保护蛋白质的能力，同时加入可以与Ca2+形成沉淀的离子让Ca2+失去作用，使芽孢热稳定性降低。

以上两种破坏机制还可以从渗透调节皮层膨胀学说角度来解释。DPA-Ca在皮层中可以固定水分，降低核心区的水分，从而提高芽孢的热稳定性。当DPA-Ca受到破坏，无法束缚住芽孢皮层内的水分，就有可能导致核心区水分增加，在外界热力作用时，皮层无法起到类似隔绝热力的作用，核心区温度上升，芽孢热稳定性下降。

3.2阻止芽孢萌发芽孢是细菌的休眠形式，这种状态对外界不产生危害，只有当芽孢萌发后，形成繁殖体，进行新陈代谢，才会引起食物腐败、致病等。因此阻止芽孢萌发，使其停留在休眠状态，等同于破坏了芽孢。

在芽孢正常萌发的过程中，核心区会释放DPA-Ca，它能激活皮层中的细胞溶解酶，进而水解肽聚糖，添加诱导剂DPA，能迅速诱导芽孢萌发，因此DPA是芽孢萌发过程中的一种关键物质，破坏DPA就能阻止芽孢萌发，使细菌处于类似深休眠的状态。

DNA既是生物遗传信息的载体，也控制着生物的新陈代谢，在芽孢中SASP是保护芽孢DNA的酸溶性蛋白，使其免受紫外线等辐射。通过改变或破坏SASP，紫外线等辐射可以破坏DNA，进而阻止芽孢的萌发。

3.3诱导芽孢成为繁殖体诱导芽孢萌发有多种方法，其中外源性DPA、L-丙氨酸、肌苷和阳离子表面活性剂等均可作为诱导剂。芽孢萌发成繁殖体后，就丧失了对外界胁迫的抗性，通过普通的高温、高压、湿热、辐射和化学消毒剂等可杀灭繁殖体，极大地降低杀菌难度。实验研究证明[26]单因素诱导芽孢萌发时，外源性DPA诱导芽孢的萌发率明显高于其他诱导因素，但不能使全部芽孢萌发，具有潜在危害性；多种诱导剂组合时，与DPA搭配的组合反而不如单独使用DPA的诱导效果好，有的组合反而降低芽孢的萌发率，甚至不萌发。因此，有针对性、合理地搭配诱导剂诱导芽孢萌发成为繁殖体是降低杀灭芽孢条件的前提。

3.4从基因角度阻止细菌产芽孢芽孢是细菌在不利环境下形成的一种特殊结构，这种结构变化需要细菌基因的控制。细菌芽孢化的第一步是Spo0A蛋白发生磷酸化[27]。Spo0A受多种调节因子的调控，其中蛋白激酶KinA可以使Spo0A前体SpoF磷酸化形成Spo0A，Spo0A磷酸化后可激活细菌芽孢化。蛋白质Sda与KinA结合，阻止KinA磷酸化而抑制Spo0A的活化[27]。所以，通过诱导编码基因sda表达蛋白质Sda，可以抑制Spo0A的形成，细菌就无法芽孢化。

3.5从基因角度降低芽孢的抵抗力芽孢的高抵抗力是在细菌形成芽孢时逐步具有的。在芽孢形成后期，细菌合成SASP，当其与DNA结合后，结构和光化学性质改变，因此芽孢耐受类似辐射作用的能力增强，并且稳定DNA结构，免受部分物理因素的破坏。研究表明SASP由多基因家族ssp编码合成[28]。改造ssp基因家族，抑制蛋白质SASP的合成，芽孢对紫外线等辐射的耐受性降低，通过紫外线就极易杀灭芽孢。DPA是细菌赖氨酸生物合成通路的中间产物，天冬氨酸依次在天冬氨酸激酶、天冬氨酸-β-半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶的催化作用下生成DPA[29]。因此，调控上述任意一种酶的相关基因，抑制其催化功能，阻止合成通路，可间接地降低DPA含量，从而降低芽孢抵抗力。

4 小结

破坏芽孢的方法多样，从芽孢的特殊成分DPA-Ca入手，减少其在核心的含量是一种重要且有效的途径，可以解决破坏芽孢需要高温高压等严格条件的问题；从芽孢多层膜结构中的皮质入手，皮质的破坏无法保证核心区的低水分状态，从而降低芽孢的热稳定性；从阻止或诱导芽孢萌发角度入手，是两个相反方向破坏芽孢的重要方法。在食品加工和发酵工业都要彻底消灭细菌芽孢，关于芽孢耐热机制和萌发机制尚未完全清楚，极大地制约了简单、高效杀灭芽孢的方法研究。在深入研究机制的基础上，充分利用现代生物工程技术，从基因、蛋白质角度探索破坏芽孢的方法，可大大提高破坏芽孢的效率，有效减少芽孢萌发引起的食品腐败、释放毒素等危害，更好地保障人类健康。