纳米银对铜绿微囊藻生物毒性的电荷效应

2024-01-29雍玲丽陈猷鹏郭劲松孙壮壮重庆大学环境与生态学院重庆400045

中国环境科学 2024年1期

雍玲丽,陈猷鹏,郭劲松,方芳,孙壮壮,晏鹏(重庆大学环境与生态学院,重庆 400045)

近几十年来,淡水蓝藻有害藻华(CyanoHABs)在全球范围内显著增加[1-2].大部分蓝藻会产生藻毒素,危害水生生物和人类健康[3].水体环境中的营养物质(氮、磷)、温度、pH 值和盐度对蓝藻的增殖有显著影响[4].目前,人类活动的加剧导致一些新兴污染物进入水生环境,如纳米颗粒[5].一些研究报道,纳米颗粒可以抑制蓝藻的生长和增殖[6-8].但是,其抑制机制尚不清楚.银纳米颗粒(AgNPs)作为代表性纳米颗粒,广泛存在于水生环境中,据估计,水环境中银纳米颗粒的浓度在纳克/升到毫克/升之间[9].AgNPs 可引起细胞膜破坏、氧化损伤和蛋白质变性,进而抑制细胞增殖.AgNPs 释放的Ag+离子和内化的AgNPs对蓝藻细胞的生物毒性在以往的研究中已被广泛报道[10-11].这些研究大多集中在AgNPs 的浓度、大小和形态对蓝藻的毒性作用[12-14].AgNPs 的表面性质,如电位、亲水性和表面官能团等,尤其是表面电荷[15]也显著地影响纳米颗粒对微生物的生物毒性.研究表明,水环境中AgNPs 表面电荷以正电荷和负电荷两种形式存在[16-17].AgNPs 表面电荷会影响其聚集性和吸附性,进而影响颗粒的生物毒性[18-19].El Badawy等[20]研究发现,带负电荷的AgNPs和芽孢杆菌细胞之间存在高度排斥,形成了限制细胞-颗粒相互作用的静电屏障.带正电荷的AgNPs 与大肠杆菌间较大的电荷差造成了对大肠杆菌较高的毒性[15].遗憾的是,很少有研究关注AgNPs 对蓝藻生物毒性的电荷效应,蓝藻如何响应和适应不同表面电荷AgNPs 的生物胁迫尚不清楚.铜绿微囊藻(M.aeruginosa)是水生环境中最常见的有害蓝藻之一.支链聚乙烯亚胺和柠檬酸盐作为常用的纳米颗粒的涂层/稳定剂,能够有效分散纳米颗粒,在本研究中,这两种涂层材料修饰的AgNPs 表面分别带有稳定的正电荷和负电荷.本研究通过研究不同表面电荷的AgNPs 对铜绿微囊藻生长状态、生理代谢特性和微观结构的影响,以期揭示AgNPs 对铜绿微囊藻生物毒性的电荷效应.研究结果将为AgNPs 对蓝藻铜绿微囊藻的生物毒性提供参考.

1 材料与方法

1.1 表征及暴露实验

支链聚乙烯亚胺包覆的AgNPs(BPEI-AgNPs,(15.23±2.17)mV)和柠檬酸盐包覆的 AgNPs(Citrate-AgNPs,(−14.36±4.21)mV)由北京德科纳米科技有限公司生产.两种AgNPs 的平均粒径为50nm,均具有光滑的球形外观和均匀的粒径分布.

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa,FACHB-132)来源于中国科学院武汉水生生物研究所(中国武汉).将处于指数生长期的铜绿微囊藻接入盛有新鲜BG1-11 培养基的500mL 无菌锥形烧瓶中(初始藻密度约为1.5×106cells/mL),再分别加入新鲜制备的NPs 母液(经600W 超声处理30min 后使用),使锥形烧瓶中NPs 最终暴露浓度分别为0(对照),0.05,0.2和0.5mg/L.每组设3 个平行试验组,培养周期为16d,实验过程培养条件为:25°C,光照强度4000lx,光暗比12h:12h.本研究中所选取的AgNPs 暴露浓度是既考虑了实际环境浓度范围,同时结合了先前研究所选择的浓度条件[21-23].整个给药过程在无菌操作台下进行.

1.2 生理代谢特性分析

通过测量藻液在680nm 波长处的OD 值(OD680)来测定藻细胞密度.采用流式细胞仪(FACSVantageSE,BD,美国)检测藻细胞凋亡情况.利用多脉冲调制叶绿素荧光仪(Phyto-PAM,Walz,Effeltrich,德国)计算和测量光合反应过程中光系统(PSII)过程的最大光能转换效率(Fv/Fm)和最大相对电子转移速率rETRmax.

将藻细胞经超声波细胞破碎仪(JY 92-IIN,650W,4s-4s)冰浴破碎5min 后用丙二醛检测试剂盒(A003-1-2,南京建成生物工程研究所,中国)测定样品中丙二醛含量.

藻细胞胞外聚合物(EPS)通过热提法提取,利用硫酸-蒽酮法测定EPS 中多糖的含量,EPS 中的蛋白用蛋白含量测定试剂盒(P930077-100T/EA,上海麦克林生化科技有限公司,中国),最后用酶标仪测定562nm 处吸光度并计算蛋白含量.多糖和蛋白的总和为EPS 含量.

用10kDa 过滤器(Millipore,德国)和电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES,Thermo,Bremen,德国)提取并测定AgNPs 在培养液中释放的Ag+离子含量,胞内Ag+离子含量测定需先对藻液样品进行前处理,包括藻液离心、清洗藻泥、超声破碎后再离心10min,得上清液进行测定.

利用扫描电子显微镜(DM 2000,LEICA,Wetzlar,德国)和透射电子显微镜(JEM-2100,JEOL,Tokyo,日本)观察藻类细胞表面微观形貌和内部结构的变化[24].

1.3 RNA 提取和转录组学分析

根据制造商的说明(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国),使用Trizol 试剂从铜绿微囊藻样品中提取总RNA,分别使用 Agilent Bioananlyzer 2100(Santa Clara,CA,美国)和Nano Photometer®分光光度计(IMPLEN,CA,美国)对总RNA 的完整性和纯度进行检测.之后利用Illumina平台生成的数据进行生物信息学分析.所有分析均使用上海美吉生物医药科技有限公司云平台(cloud.majorbio.com)进行,使用edgeR、DESeq2 和DESeq 软件进行基因差异表达分析.

1.4 统计分析

所有实验过程和结果的测定重复3 次,然后使用IBM SPSS Statistics 26 软件进行显著性分析,数据以平均值±标准差表示,以P<0.05 为显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 对铜绿微囊藻生长和光合活性的影响

藻细胞密度是反映藻细胞生长情况的基本指标之一.对照组铜绿微囊藻细胞密度逐渐增大,而AgNP组细胞密度先增大后减小(图1A 和1B).此外,3 种浓度下的BPEI-AgNPs 在第2d 均对铜绿微囊藻生长呈现显著抑制(P<0.05),而3 种浓度的Citrate-AgNPs 在第6d 均显著抑制藻细胞生长(P<0.05).6d 后,Citrate-AgNP组铜绿微囊藻生长抑制率大于BPEI-AgNP组.这表明BPEI-AgNPs 在早期对铜绿微囊藻的生长有较强的抑制作用,而Citrate-AgNPs 在后期的抑制作用更大.与相同浓度的BPEI-AgNPs 相比,0.05,0.2 和0.5mg/L Citrate-AgNPs 对藻细胞生物量的最大抑制率分别高48.73%,83.57%和96.8%,说明带负电荷的AgNPs 对铜绿微囊藻的生长抑制作用比带正电荷的AgNPs 更强.

图1 AgNPs 对铜绿微囊藻藻密度和光合作用参数的影响Fig.1 Effects of AgNPs on algal density and photosynthetic parameters of M.aeruginosa

Fv/Fm是最大光化学效率,rETRmax通常用来表征光合作用的最大电子传递速率,两者都是表征藻类细胞光合系统II活性的常用指标[25].AgNP处理组的Fv/Fm低于对照组,说明铜绿微囊藻的光合活性受到抑制(图1C).BPEI-AgNPs 在前期对光合系统II 抑制作用更强,而Citrate-AgNPs 在后期抑制作用更为显著.此外,对于Fv/Fm的最大抑制率,0.05,0.2 和0.5mg/LCitrate-AgNP 组分别比同浓度BPEI-AgNP 组高17.72%,22.2%和34.24%.同时0.05,0.2 和0.5mg/L BPEI-AgNP 组的rETRmax峰值分别为12.05,13.20 和9.72μmol/(m2·s),Citrate-AgNP 组的rETRmax峰值分别为11.90,10.06和8.25μmol/(m2·s)(图1D),这表明铜绿微囊藻暴露于带负电荷的AgNPs 下具有较低的能量代谢活性.

2.2 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 对铜绿微囊藻的氧化损伤

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物,可以指示细胞被AgNPs 氧化损伤的程度[26].暴露于两种AgNPs 后,铜绿微囊藻细胞内MDA 含量均高于对照组(图2A 和2B),说明AgNPs 的加入导致铜绿微囊藻细胞膜脂质过氧化,破坏膜的流动性、通透性和细胞膜的完整性[11].随着暴露时间延长,BPEIAgNP 处理组MDA 含量先升高后稳定,Citrate-AgNP 处理组MDA 含量一直升高.此外,各浓度Citrate-AgNP 组的 MDA 峰值含量最终均高于BPEI-AgNP 组,其中,0.5mg/L Citrate-AgNP 组的丙二醛(MDA)含量峰值(100.8nmol/mgprot))是同浓度BPEI-AgNP 组(82.5nmol/mgprot)的1.22 倍.这说明Citrate-AgNPs 造成了更大的氧化损伤.

图2 AgNPs 暴露下铜绿微囊藻的MDA,EPS 和胞内外Ag+含量变化情况Fig.2 The changes in MDA,EPS,and intracellular and extracellular Ag+ content in M.aeruginosa under AgNPs exposure

胞外聚合物(EPS)常被用作藻细胞抵抗环境胁迫的方式之一,其含量可间接指示藻细胞所受胁迫的程度.暴露于这两种AgNPs 的铜绿微囊藻细胞分泌明显更多的EPS(P<0.05),且EPS 含量与AgNPs浓度基本呈正相关(图2C),这表明BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 都会引起铜绿微囊藻的应激反应且应激反应程度具有剂量效应.于朋飞等[27]也发现铜绿微囊藻细胞可分泌胞外物质吸附细胞附近的AgNPs 颗粒.铜绿微囊藻在BPEI-AgNPs 作用下分泌的EPS 含量大于Citrate-AgNPs 作用下分泌的EPS 含量,第16d,0.5mg/L BPEI-AgNP 组的EPS 含量(32.21mg/gSS)是同浓度Citrate-AgNP 组(4.42mg/gSS)的7.29 倍.这说明铜绿微囊藻对BPEI-AgNPs更为敏感,分泌大量EPS 以减轻BPEI-AgNPs 的毒性.因此,铜绿微囊藻对带正电荷的AgNPs 具有更强的耐受性,BPEI-AgNPs对铜绿微囊藻的生长抑制和细胞生理代谢损伤较低.

为进一步揭示不同表面电荷AgNPs 对铜绿微囊藻的影响,测定了0.5mg/L AgNP 处理组胞内外Ag+的释放情况(图2D).两种AgNP 组中,胞内外Ag+含量随暴露时间的增加而增加.此外,BPEI-AgNP 组胞内外Ag+含量在早期均较高,而Citrate-AgNP 组在后期均显著升高.最终Citrate-AgNP 组胞内外Ag+含量分别为BPEI-AgNP 组的2.13 倍和1.63倍.Ag+含量的变化与铜绿微囊藻中MDA 含量和细胞损伤的变化一致,表明Ag+的释放量在不同电荷下AgNPs 的毒性中起重要作用.

2.3 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 对铜绿微囊藻细胞形态的影响

通过SEM 观察0.5mg/L 不同电荷AgNPs 作用下铜绿微囊藻的表面形貌,结果如图3所示.BPEIAgNPs 聚集在铜绿微囊藻细胞表面(第4d)(图3A),然而,未观察到Citrate-AgNPs 吸附在铜绿微囊藻的表面,细胞表面也无明显变化(第4d)(图3B).这表明BPEI-AgNPs 可因静电引力而吸附在带负电荷的铜绿微囊藻细胞表面,进而可能导致掩蔽效应[28-29],使得早期BPEI-AgNPs 严重抑制了铜绿微囊藻对光能的吸收和利用.16d 后,暴露于BPEIAgNPs 的铜绿微囊藻细胞表面出现大量EPS,其中包裹着BPEI-AgNPs(图3C),说明BPEI-AgNPs 刺激铜绿微囊藻分泌大量EPS,进而减轻了BPEIAgNPs 的毒性.暴露于Citrate-AgNPs16d 后,细胞表面皱缩、碎裂,细胞形态不完整(图3D),这可能与处理后期 Citrate-AgNPs 引起的强烈的氧化损伤(MDA 含量激增)有关.透射电镜也得到了类似的结果(图3E 和3F).同时在藻细胞内部观察到少量BPEI-AgNP,但未观察到有Citrate-AgNPs 存在.此外,暴露于Citrate-AgNPs 后,铜绿微囊藻细胞表现出明显的损伤(图3E 和3F),这与Citrate-AgNPs 作用后期大量Ag+释放到细胞中有关,大量Ag+进入铜绿微囊藻细胞后可能干扰酶活性中心,刺激了ROS 的产生[30],造成了比BPEI-AgNPs 更严重的细胞损伤.

图3 AgNPs 暴露下铜绿微囊藻的扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)图像Fig.3 Scanning electron microscope(SEM)and transmission electron microscope(TEM)images of M.aeruginosa under AgNPs exposure

2.4 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 对铜绿微囊藻细胞凋亡的影响

采用流式细胞术检测两种AgNPs 对铜绿微囊藻细胞凋亡的影响.Q3-UL、Q3-UR、Q3-LR 和Q3-LL 分别代表坏死区、晚凋区、早凋区和活菌区.对照组存活细胞比例从第 0d(96.84%)到第 16d(96.15%)基本保持不变,对照组坏死、早凋和晚凋区细胞比例均小于3%,从第0～16d 无明显变化(图4A和4B).16d 时,AgNP 处理组活细胞比例低于对照组,坏死和早凋细胞比例高于对照组.0.05,0.2 和0.5mg/LCitrate-AgNP 处理组的活细胞比例分别比BPEIAgNP 处理组低2.79%,16.14%和20.79%(16d).各浓度水平下,Citrate-AgNP 处理组的坏死细胞和早凋细胞比例均高BPEI-AgNP 处理组,说明在整个试验周期内,Citrate-AgNPs 对铜绿微囊藻细胞的损伤更大,这与生物量的变化趋势一致.

图4 AgNPs 对铜绿微囊藻细胞凋亡的影响Fig.4 Effects of AgNPs on apoptosis of M.aeruginosa cells

2.5 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下铜绿微囊藻的转录组

GO 富集分析结果显示,BPEI-AgNPs 对铜绿微囊藻的影响主要涉及能量代谢、光合作用和胞外聚合物相关途径(图5A 和5B).其中,铁硫簇结合途径基因显著富集(FDR=0.045),说明BPEI-AgNPs 显著抑制了铜绿微囊藻光合作用和呼吸作用中的相关电子传递过程.此外,胞外聚合物代谢相关的糖胺聚糖代谢基因和肽聚糖代谢基因表达显著上调,这可能是藻细胞减轻BPEI-AgNPs 毒性的机制之一.Citrate-AgNP 组差异基因的GO 富集分析结果如图5C 和5D所示.光合色素合成和含卟啉化合物代谢相关基因表达量显著下调(FDR<0.01),表明Citrate-AgNPs 干扰了铜绿微囊藻对光能的吸收利用.同时,呼吸通路相关基因表达量显著下调(FDR<0.01),能量代谢受到Citrate-AgNPs 的严重影响.值得注意的是,与离子跨膜转运蛋白活性相关的基因表达显著上调(FDR=0.037).因此,后期大量Ag+进入铜绿微囊藻细胞,刺激SOD 活性增强以降低活性氧水平.

图5 AgNPs 暴露下铜绿微囊藻差异基因GO 富集分析及KEGG 富集分析热图Fig.5 Heat maps of differential gene GO enrichment and KEGG enrichment in M.aeruginosa exposed to AgNPs

2.6 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下铜绿微囊藻的分子调控网络

2.6.1 与光合作用和能量代谢相关的调控途径在BPEI-AgNP 和Citrate-AgNP 组中,分别有14个和15 个与卟啉和叶绿素代谢相关的基因下调(图5E 和5F).rbcS 和rbcL 编码了参与光合碳固定生成3-磷酸-D-甘油(PGA)的羧化过程[31-32].铜绿微囊藻中rbcS 的表达量在BPEI-AgNP(Log2FC=-1.04)和Citrate-AgNP(Log2FC=-1.12)组中显著下调,rbcL 的表达量在 BPEI-AgNP(Log2FC=-2.04)和 Citrate-AgNP(Log2FC=-2.16)组显著下调(图6).同时,fbp、tktA 和prk 负责调节产生β-D-果糖6-磷酸(F6P)、D-酮糖-5-磷酸(RP)和核糖1,5-二磷酸(RuBP)的酶促反应,在Citrate-AgNP 组中,它们的下调幅度更大.por涉及调节丙酮酸(PYR)转化为乙酰辅酶A过程,BPEI-AgNP(Log2FC=-2.31)和Citrate-AgNP(Log2FC=-2.75)组por 的表达水平均下调,Citrate-AgNP 组下调水平更高.在两种AgNPs 胁迫下,cs 和pckA 表达水平分别上调和下调,草酰乙酸(OAA)浓度升高,从而向柠檬酸(CIT)转化效率提高,这可能是铜绿微囊藻细胞应对两种AgNPs 胁迫相同的补偿策略之一.此外,BPEI-AgNP 组有其他补偿方式:提高了pyk 的基因表达水平,增加了将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转化为PYR的酶的表达,促进了PYR的合成.以上结果说明BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 抑制光捕获和能量转换,同时Citrate-AgNPs 的抑制率较高,可能与大量Ag+的侵入有关,最终导致铜绿微囊藻的生长受到明显抑制.

图6 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下铜绿微囊藻光合作用、能量代谢和氧化应激途径的KEGG 分析Fig.6 KEGG analysis of photosynthesis,energy metabolism and oxidative stress pathways in M.aeruginosa exposed to BPEI-AgNPs and Citrate-AgNPs

2.6.2 与氧化应激相关的调控途径暴露于两种AgNPs 时,sod2 表达上调,且Citrate-AgNP 组上调幅度(log2FC=1.33)高于 BPEI-AgNP 组(log2FC=1.03)(图6),说明两种AgNPs 均刺激了铜绿微囊藻中SOD 酶的转录,Citrate-AgNP 组转录更多.而GPX 参与了过氧化氢转化为分子水的过程,其表达量在BPEI-AgNP 和 Citrate-AgNP 组中均表现为下调.sod2 基因的上调和GPX 基因的下调导致藻类细胞中过氧化水平升高.结合第16d BPEI-AgNP 组和Citrate-AgNP 组MDA 水平的激增,我们推测暴露于两种AgNPs 的铜绿微囊藻细胞受到了严重的氧化损伤,且Citrate-AgNP 组藻细胞损伤程度更大.

2.6.3 与细胞外聚合物合成相关的调控途径缬氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)等氨基酸是细胞外蛋白(PN)的主要前体.pdhA、pdhB 和aceF 的表达调节了PEP 向Val和Leu 的转化,它们在BPEI-AgNP 组的表达量均显著上调(Log2FC>1)(图7).相比之下,暴露于Citrate-AgNPs 后,铜绿微囊藻中 pdhB 的表达量上调(Log2FC=1.27),然而pdhA 和aceF 的表达量均有下调.尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDPGlcNAc)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和甘露糖6-磷酸(Man-6P)是胞外多糖的重要前体,其中glmM 和glmU 参与调节葡萄糖胺6-磷酸(GlcN-6P)向UDP-GlcNAc 的转化.两种AgNPs 均刺激glmM和glmU的表达,且BPEI-AgNP组上调幅度更大.ugd参与尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)向UDP-GlcA 的转化,BPEI-AgNP 组(Log2FC=0.67)的ugd 表达上调幅度高于Citrate-AgNP 组(Log2FC=0.58).此外,编码Man-6P 合成的 manA 表达在 BPEI-AgNP 组(Log2FC=1.13)中表现为上调,而在Citrate-AgNP 组(Log2FC=-1.15)中为下调.

图7 BPEI-AgNPs 和Citrate-AgNPs 暴露下铜绿微囊藻氨基酸和氨基糖途径的KEGG 分析Fig.7 KEGG analysis of amino acid and amino sugar pathways in M.aeruginosa exposed to BPEI-AgNPs and Citrate-AgNPs

与Citrate-AgNPs 相比,BPEI-AgNPs 显著促进了PN 和PS 前体的合成,说明铜绿微囊藻分泌EPS包裹BPEI-AgNPs并中和其毒性,而在Citrate-AgNP组中EPS 分泌不足,因此Citrate-AgNPs 对藻细胞的生长抑制和氧化损伤程度均大于BPEI-AgNPs.

本研究有效揭示了不同表面电荷AgNPs 对铜绿微囊藻的生物毒性效应,为探究银纳米颗粒潜在的生态风险以及蓝藻水华的防治策略提供了理论支撑.