辛芳鼻炎胶囊对大鼠变应性鼻炎的改善作用

张 勇，张 斌，吴 瑕，宋 纹

（1.天津医科大学总医院中医科，天津 300052； 2.黄骅神农居医院中医科，河北 沧州 061100； 3.天津宏仁堂药业有限公司，天津 300385）

辛芳鼻炎胶囊主要由辛夷、白芷、细辛等10 余味药物组成，常用于治疗慢性鼻炎、鼻窦炎。早期研究已初步证实辛芳鼻炎胶囊具有抗炎，抗过敏等药理作用［1］，近年来亦有该药物用于治疗变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的散在临床报道［2-3］，但目前尚未见该药物干预AR 动物模型的实验研究报道。本研究拟通过建立AR 大鼠模型，对辛芳鼻炎胶囊抗炎、抗过敏药理作用及其干预机制进行初步研究，以期为扩大其临床适应症提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京）2016-0006］，体质量160～200 g，分笼饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心空调动物房，室温22 ～26 ℃，相对湿度55% ～65%，12 h／12 h 昼夜节律光照，自由进食、饮水，定期更换、消毒饲养笼，保持环境清洁，适应性饲养3 d 后开始实验。本研究方案经过中国医学科学院放射医学研究所伦理委员会审核并通过（伦理号IRMDWLL-2020078）。

1.2 药物与试剂 辛芳鼻炎胶囊（规格0.25 g／粒，批号BL09002，天津宏仁堂药业有限公司）； 氯雷他定片［规格10 mg／片，批号JS12630，拜耳医药（上海）有限公司］。卵清蛋白 （OVA）、氢氧化铝 ［Al （OH）3］（批号SLBX8657、WXBB1151，美国Sigma 公司）； 吸入用七氟烷（批号20011431，上海恒瑞医药有限公司）； 10%缓冲中性甲醛（批号B09D00119，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）； 大鼠OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4、IFN-γ ELISA试 剂 盒 （ 货 号 ML620587、ML002986、ML003188、ML102825、ML002833，上海酶联生物科技有限公司）。

1.3 仪器 DNM-9602 型酶标仪［普朗科（北京）科技有限公司］； DM3000 型光学显微镜、DFC 420C 型显微数码成像系统（德国徕卡公司）； TL-18M 型台式高速冷冻离心机（上海离心机械研究所有限公司）； AL204 型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

2 方法

2.1 大鼠AR 模型的建立

2.1.1 全身致敏 参照宋兴兴等［4］报道的方法并加以改进，首先将OVA 溶于无菌生理盐水 （终质量浓度为0.4 mg／mL），然后与等体积氢氧化铝混悬液混合均匀，每只大鼠腹腔注射混合液l mL （含0.2 mg OVA 和20 mg 氢氧化铝），隔日致敏1 次，连续致敏7 次； 对照组大鼠腹腔注射等体积无菌生理盐水。

2.1.2 鼻腔激发 第15 天至第21 天，大鼠经七氟烷吸入短暂全身麻醉后，以5% OVA 溶液双侧滴鼻，每次50 μL／鼻孔，每天1 次，对照组大鼠以等体积生理盐水滴鼻。在末次滴鼻完成后，观察大鼠喷嚏、抓鼻及流涕情况，按赵氏叠加量化计分法［5］进行评估，观察时间30 min，总分≥5 分表示造模成功。评分标准为①鼻痒，大鼠抓鼻1 ～5次记为1 分，6～10 次记为2 分，10 次以上记为3 分； ②喷嚏，大鼠打喷嚏4 个以下记为1 分，4～10 个记为2 分，10个以上记为3 分； ③流涕，大鼠鼻涕流至鼻前孔记为1 分，超过鼻前孔记为2 分，涕流满面记为3 分。将造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（氯雷他定）及辛芳鼻炎胶囊低、中、高剂量组，每组8 只。

2.2 药物干预 所有药物事先均以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液悬浮，使用前充分摇匀，其中辛芳鼻炎胶囊低、中、高剂量分别为0.25、0.5、0.75 g／kg，氯雷他定剂量为1 mg／kg［6］。自第22 天（造模结束24 h 后）开始，各给药组大鼠分别灌胃给予相应药物混悬液，对照组及模型组大鼠均予以等量0.5% CMC-Na 溶液灌胃，每天1次，连续干预14 d。

2.3 行为学观察 末次给药结束后，按照“2.1.2” 项下评分标准，再次对大鼠进行行为学观察和评分，观察时间30 min。

2.4 标本采集 第36 天（干预结束24 h 后），所有大鼠经10%水合氯醛溶液（300 mg／kg）腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血5 mL，置于含有惰性分离胶和促凝剂的真空取血管中静置2 h 后，3 000 r／min 离心15 min，血清经分装后置于-40 ℃保存备用。取血完毕后迅速沿鼻中线剪开大鼠鼻腔，暴露鼻中隔及双侧鼻腔，提取鼻中隔（含鼻中隔软骨及其双侧黏膜），置于10% 缓冲中性甲醛溶液中固定72 h。

2.5 鼻黏膜组织病理观察 鼻黏膜组织标本放入5%甲酸溶液中脱钙3 d，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚度4 μm），HE 染色后封片，于光学显微镜下观察鼻腔组织内覆盖各部位的黏膜上皮细胞有无变性、坏死，黏膜下有无充血、水肿及炎细胞浸润，鼻腔内有无炎性分泌物等。

2.6 细胞因子水平检测 采用ELISA 法检测大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平，严格参照试剂盒说明书操作，于酶标仪450 nm 波长处读取吸光度，采用标准曲线法计算相应细胞因子浓度值。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较方差齐性时采用LSD 检验，方差不齐时则采用Tamhane 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 辛芳鼻炎胶囊对AR 大鼠一般情况的影响 在造模阶段，对照组大鼠饮食及日常行为活动无异常，被毛光亮柔顺，无频繁的喷嚏、抓鼻、流涕等表现； 与对照组比较，其余各组大鼠体质量减轻，活动力下降，常可看到前鼻孔甚至睑结膜潮湿，频繁出现喷嚏、抓鼻动作，部分大鼠可见血性鼻涕，少数大鼠还会出现一过性喉中哮鸣音。

3.2 辛芳鼻炎胶囊对AR 大鼠行为学评分的影响 如表1所示，给药前，各给药组与模型组大鼠行为学评分比较无差异（P＞0.05）。给药结束后，与对照组比较，模型组大鼠行为学评分升高（P＜0.05）； 与模型组比较，辛芳鼻炎胶囊中、高剂量组以及阳性对照组大鼠行为学评分降低（P＜0.05）。

3.3 辛芳鼻炎胶囊对AR 大鼠鼻黏膜组织病理学变化的影响 对照组大鼠鼻黏膜组织结构完整清晰，表面覆有假复层柱状纤毛上皮，上皮间有多量分泌黏液的杯状细胞，上皮细胞排列整齐，平滑，没有杯状细胞増生，黏膜下层腺体正常，未见增生，无嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞侵润，血管无扩张充血； 模型组大鼠鼻黏膜上皮细胞有不同程度的脱落、坏死，杯状细胞增生，出现明显的小血管扩张和组织间隙水肿现象，存在以嗜酸性粒细胞为主的炎细胞广泛浸润，腺体增生、肿胀，黏膜表面分泌物增多； 各给药组大鼠鼻黏膜较模型组有不同程度的改善，炎性浸润，小血管扩张和组织间隙水肿均减轻，其中阳性对照组和辛芳鼻炎胶囊中、高剂量组变化相近，见图1。

图1 各组大鼠鼻黏膜组织病理学观察（HE，×400）

3.4 辛芳鼻炎胶囊对AR 大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS、IL-4I 及FN-γ 水平的影响 如表2 所示，与对照组比较，模型组大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平升高（P＜0.05），IFN-γ 水平降低（P＜0.05）； 与模型组比较，辛芳鼻炎胶囊中、高剂量组及阳性对照组大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平降低（P＜0.05），IFN-γ水平升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平比较（x±s，n＝8）

4 讨论

AR 又称过敏性鼻炎，是人体接触变应原后，由免疫球蛋白E （IgE）介导而涉及多种免疫细胞和炎症因子共同参与的鼻黏膜非感染性疾病，属于Ⅰ型变态反应性疾病［7］。该病典型症状为阵发性喷嚏，大量清水样涕，鼻痒及鼻塞等，其发病率占整个人群的10% ～20%［8］。

AR 发病机制错综复杂，至今尚未完全明确，已知当机体首次接触变应原后，经抗原呈递细胞传递给Th 细胞，并分化为Th2 细胞，Th2 细胞进而诱导B 细胞分泌IgE 并聚集于鼻黏膜。当变应原再次进入机体内时，将会与IgE 结合，诱发肥大细胞脱颗粒后释放组胺、白三烯等炎性递质，促进嗜酸粒细胞浸润，致使鼻黏膜上皮细胞损伤，毛细血管扩张，通透性增高，腺体分泌增加，引起鼻塞、喷嚏、流涕等症状［9］。体内IgE 异常表达是诱发此类鼻炎的主要原因，且血清总IgE 水平与患者病情严重程度呈正相关［10］。已有研究表明，组胺是引起机体过敏反应的重要的血管活性物质，其在体内具有促进血管扩张、增强毛细血管通透性及腺体分泌增加等效应，介导了I 型变态反应的发生［11］。氯雷他定作为第二代抗组胺药物，具有抑制肥大细胞释放白三烯和组胺等药理作用，是当前治疗AR 的一线口服药物，故本研究将其作为阳性对照药物。目前普遍认为Th1／Th2 细胞免疫失衡是引起AR 的关键［12］，Th1 细胞主要分泌IL-2、IFN-γ 等细胞因子以参与细胞免疫应答； Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5 等细胞因子以参与体液免疫应答，其中IL-4 能够促进β 细胞转变为浆细胞合成IgE，抑制IFN-γ 产生； 而IFN-γ 是IL-4 合成的生物拮抗剂，能增强Th1 细胞活性，抑制β 细胞合成IgE 和抑制Th0 细胞分化Th2 型细胞［13］，IL-4 和IFN-γ 常作为监测Th 反应的检测指标。当特异性抗原作用于特应性个体时，抗原信号呈递给T 辅助淋巴细胞，使Th 细胞分化发生偏移，从而导致Th1／Th2 细胞因子网络平衡失调，出现Th2＞Th1 反应［14］。

现代药理研究表明，辛夷的主要有效成分辛夷油能够抑制Th2 细胞介导的免疫效应，减少组胺的释放，并且能够上调Thl／Th2 的比值，促进IL-4、干扰素的表达，从而对AR 发挥一定的治疗作用［15］。柴胡中的柴胡皂苷可抑制炎症组织中组胺的释放，抑制白细胞游走［16］。防风的提取物能减少致敏小鼠血清IgE 的产生，从而延迟或减轻由卵蛋白致敏引起的I 型变态免疫反应［17］。有研究表明，白芷内的挥发油不但能够抑制AR 患者肥大细胞脱颗粒，而且还能够有效地对抗组胺引起的致炎反应，降低毛细血管通透性，减轻或消除AR 症状［18］； 另有报道称，白芷干预AR小鼠后，能有效改善小鼠的过敏性鼻炎症状，减轻其鼻黏膜组织损伤，其机制可能与下调Th17 比例，上调Treg 比例，恢复Th17／Treg 平衡有关［19］。有研究表明，黄芩的主要活性成分黄芩苷可调节Th1／Th2 细胞失衡，抑制IL-33／ST2 信号通路，对AR 治疗作用明显［20］； 另有报道称，黄芩苷能够缓解OVA 诱导的小鼠AR 症状，其机制与通过抑制细胞自噬来调控Th17／Treg 细胞分化平衡有关［21］。

本研究证实辛芳鼻炎胶囊可明显改善AR 大鼠鼻黏膜症状，其机制与降低血清中OVA-sIgE、LTC4、HIS 和IL-4水平，升高血清IFN-γ 水平有关。