益肾化湿颗粒对MsPGN 大鼠肾组织TGF-β1 信号通路和ERK1／2 磷酸化的影响

许晓刚，张春江，付彦杰，董王钰，杨晓萍

（石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000）

在我国，肾小球肾炎仍是引起慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的主要原因［1］。系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）为原发性肾小球肾炎最常见的类型［2-3］，其以肾小球系膜细胞增生和细胞外基质积累为主要病理特征，随着病情发展可出现肾小球硬化以及肾间质纤维化，并进一步进展至CKD乃至终末期肾病［4］。

目前，有关于MsPGN 的发病原因及进展机制尚未完全阐明，有研究指出，在MsPGN 大鼠肾组织中，TGF-β1、p-Smad2／3 及p-ERK1／2 表达升高［5-6］。TGF-β／Smads 信号通路在多种类型肾脏疾病中被认为是驱动肾小球硬化和小管间质纤维化的关键，是CKD 进展的核心［7］。ERK 作为MAPK 的家族成员之一，参与细胞的增殖、分化、迁移［8］，有学者认为活化的ERK1／2 是出现蛋白尿和肾小球硬化的主要上游中介［9］。因此，靶向TGF-β／Smads 和ERK 信号通路延缓肾脏病进展是MsPGN 的主要治疗策略。

多项临床研究表明，益肾化湿颗粒可减轻慢性肾小球肾炎患者尿蛋白，具有消肿及延缓肾功能恶化功效，然而其分子机制尚未阐明［10-11］。课题组前期研究发现，益肾化湿颗粒可下调PI3K／Akt 信号通路降低MsPGN 大鼠蛋白尿，同时可延缓肾小球硬化及肾间质纤维化的进展，具体机制有待进一步阐明［12］。本研究旨在建立大鼠慢性抗Thy-1 肾炎模型探究益肾化湿颗粒是否介导TGF-β／Smads／ERK 通路活化参与MsPGN 的肾保护作用。

1 材料

1.1 动物 雄性SPF 级别SD 大鼠30 只，8 周龄，体质量200～250 g，购自新疆医科大学动物实验中心［实验动物生产许可证号SCXK （新）2018-0002］，饲养环境为室内温度22～26 ℃，相对湿度40% ～70%，自由饮水摄食。本实验相关操作均通过石河子大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准［伦理号2022 伦审（151）号］。

1.2 药物与试剂 益肾化湿颗粒（规格10g／袋，国药准字Z20090250，广州康臣药业有限公司）； 缬沙坦分散片（规格80 mg／片，国药准字H20090092，鲁南贝特制药有限公司）。兔抗大鼠Thy-1 多克隆抗体（货号bs-0778R，北京博奥森生物技术有限公司）； 尿蛋白定量测试盒（货号C035-2-1，南京建成生物工程研究所有限公司）； TGF-β1抗体（货号ab215715，英国Abcam 公司）； 兔抗p-Smad2／3［货号abs130992，爱必信（上海）生物科技有限公司］；Smad2／3 抗体、ERK1／2 抗体、p-ERK1／2 抗体、Fibronectin抗体、GAPDH 多克隆抗体、HRP-山羊抗兔二抗 （货号BA1395、BM4326、BM4156、M00564-3、A00227-1、BM3894，武汉博士德生物工程有限公司）； 二氨基联苯胺（DAB）、牛血清白蛋白（BAS）、ECL 发光液、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸化蛋白酶抑制剂（武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.3 仪器 光学显微镜（日本Olympus 公司）； 高速冷冻离心机、NanoDrop2000 核酸蛋白定量仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；酶标仪、电泳仪、PCR 扩增仪（美国Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 造模、分组及给药 所有大鼠适应性饲养1 周后在麻醉下行左肾摘除术，术前禁食不禁水10 h，术后自由摄食水。单肾摘除1 周后随机选取6 只大鼠经尾静脉注射生理盐水作为对照组，其余24 只大鼠参考文献［13］报道，经尾静脉注射2.5 mg／kg 的Thy-1 抗体复制慢性不可逆型大鼠肾炎模型。将抗Thy-1 肾炎大鼠随机分为为模型组、缬沙坦（8.5 mg／kg）组和益肾化湿颗粒低、高剂量组（3.125、6.25 g／kg），每组6 只分笼饲养。益肾化湿颗粒溶于40 ℃生理盐水配制成质量浓度为0.5 g／mL 的溶液； 缬沙坦分散片溶于40 ℃生理盐水配制成质量浓度为2.0 mg／mL 的溶液。各给药组灌胃给予相应药物，对照组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，每天1 次，连续6 周。

2.2 一般情况观察 观察大鼠精神、活动度、饮水摄食情况、皮毛光泽度及体质量变化。计算大鼠体质量增速，公式为体质量增速＝ （处死前体质量-造模前体质量）／42。

2.3 尿蛋白定量检测 造模后第7、14、28、42 天，采用代谢笼分别收集各组大鼠24 h 尿液，采用考马斯亮蓝法（CBB）测定尿蛋白水平。

2.4 血清肌酐、尿素氮水平检测 给药结束后，腹腔采血，离心取血清，于-80 ℃冰箱中保存，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐、尿素氮水平。

2.5 肾组织病理学检测 给药结束后处死大鼠，取右肾称量湿重，部分肾组织置于-80 ℃冰箱冰冻保存； 其余部分肾组织于4%多聚甲醛中固定，脱水、透明后浸蜡，石蜡包埋并切片（厚度3.0 μm）。分别对切片进行HE、Masson染色，于显微镜下观察并拍照； 采用Image J 软件对采集的图像进行半定量分析，估计肾小球内细胞核数，计算蓝色染色面积并赋分评估肾组织纤维化程度（蓝染面积≤5%记为0 分，5%＜蓝染面积≤25%记为1 分，25% ＜蓝染面积≤50%记为2 分，50%≤蓝染面积＜75%记为3 分，蓝染面积≥75%记为4 分），每只大鼠至少评估10 个肾小球。

2.6 免疫组化（IHC）染色检测肾组织TGF-β1的分布及表达强度 石蜡切片常规脱蜡至水，EDTA 微波抗原修复后磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，3% 过氧化氢（H2O2）室温孵育10 min 清除内源性过氧化物酶活性，PBS 冲洗，BSA 室温封闭20 min，加入TGF-β1一抗（1 ∶500），4 ℃孵育过夜，PBST 冲洗后加入二抗（1 ∶500），室温孵育30 min，PBST 冲洗后DAB 显色，自来水冲洗，复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片，于光镜下观察细胞浆或细胞膜出现棕色颗粒沉积为阳性。将采集图片参考文献［14］报道方法，应用Image J 软件计算平均光密度值（AOD），以此评估TGF-β1染色面积及强度。

2.7 Western blot 法检测肾组织TGF-β1、Smad2／3、FN 及ERK1／2 蛋白表达 取于-80 ℃冰箱中保存肾组织，剪取约50 mg 放入无酶EP 管中，加入RIPA 裂解液并在预冷研磨机中充分研磨至悬混液，12 000 r／min 离心30 min 后取上清液，采用BCA 法测定蛋白浓度后统一配平为2 μg／μL 的蛋白样品，水浴锅中煮沸10 min 使蛋白充分变性。取5 μL 样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离目的蛋白，转至PVDF 膜，加入脱脂奶粉或BSA 封闭，加入TGF-β1（1 ∶ 1 000）、Smad2／3 （1 ∶ 500）、p-Smad2／3（1 ∶500）、FN （1 ∶1 000）、ERK1／2 （1 ∶500）、p-ERK1／2（1 ∶500）及GADPH （1 ∶1 000）一抗于4 ℃冰箱中摇床孵育过夜，TBST 溶液洗涤3 次，每次10 min，室温下孵育二抗（1 ∶5 000）2 h，清洗后加入ECL 发光液并于暗室曝光。以GAPDH 为内参，应用Image J 软件分析各组蛋白相对表达量。

2.8 RT-qPCR 法检测肾组织TGF-β1、FNmRNA 表达 取于-80 ℃冰箱中保存肾组织，采用TRIzol 法提取总RNA，通过Nanodrop 仪器测定RNA 浓度，将其反转录为cDNA，按照试剂盒说明书配制25 μL 反应体系，进行PCR 扩增，反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，共循环40 次。以GAPDH为内参计算各组CT值，以2-ΔΔCT法计算TGF-β1、FNmRNA 表达。根据美国国家生物信息中心（NCBI）Primer-BLAST 设计引物，由美国Thermo Fisher Scientific 公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

2.9 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况 实验过程中无大鼠死亡。对照组大鼠精神状态、活动性、皮毛光泽度、饮食情况以及大小便方面表现均良好； 模型组大鼠有不同程度的精神状态不佳，食量、活动度及皮毛光泽度下降等情况，总体体质量增长率较对照组稍偏低； 而益肾化湿颗粒各剂量组大鼠随着药物干预进程，精神状态、摄食积极性较前有明显好转，食量、活动度增加。如表2 所示，益肾化湿颗粒各剂量组体质量增长速率较模型组和缬沙坦组均升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各组大鼠体质量增速比较（x±s，n＝6）

3.2 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠24 h 尿蛋白定量的影响 如表3 所示，与对照组比较，模型组大鼠各时间点24 h 尿蛋白水平均升高（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组和缬沙坦组随着给药时间推移，24 h 尿蛋白水平降低更明显（P＜0.05，P＜0.01）； 与益肾化湿颗粒低剂量组比较，益肾化湿颗粒高剂量组和缬沙坦组大鼠24 h 尿蛋白水平降低更明显（P＜0.05）。

表3 各组大鼠24 h 尿蛋白定量比较（mg，x±s，n＝6）

3.3 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠肾功能的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清肌酐、尿素氮水平升高（P＜0.05）； 与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组和缬沙坦组大鼠血清肌酐、尿素氮水平降低（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠肾功能比较（x±s，n＝6）

3.4 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠肾组织病理变化的影响 如图1A 所示，对照组大鼠肾小球结构基本正常； 而模型组大鼠肾组织主要呈现出不同程度且不可逆的系膜细胞增生及细胞外基质弥漫性增多的病理改变，部分肾小球内毛细血管受压、管腔狭窄，出现广泛胶原蛋白沉积，结合尿蛋白定量结果，提示本实验慢性MsPGN 动物模型复制成功； 益肾化湿颗粒各剂量组和缬沙坦组大鼠肾组织系膜细胞及系膜基质异常增殖情况有一定程度的改善。

图1 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠肾组织病理变化的影响（×400，±s，n＝6）

如图1B～1C 所示，与对照组比较，模型组大鼠肾小球内核计数增加（P＜0.01），纤维化程度加重（P＜0.01）；与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组和缬沙坦组肾小球内核计数减少（P＜0.01），纤维化程度减轻（P＜0.01）；与益肾化湿颗粒低剂量组比较，益肾化湿颗粒高剂量组和缬沙坦组肾组织病理损伤缓解效果更佳 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.5 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠肾组织TGF-β1分布及表达强度的影响 如图2、表5 所示，与对照组比较，模型组大鼠肾小管上皮细胞胞浆及肾小球系膜区呈现不同程度的棕色颗粒沉积，AOD 值较高（P＜0.01）； 与模型组比较，益肾化湿颗粒各剂量组和缬沙坦组大鼠肾组织TGF-β1表达强度降低（P＜0.01）； 与益肾化湿颗粒低剂量组比较，益肾化湿颗粒高剂量组和缬沙坦组大鼠AOD 值较低（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肾组织TGF-β1 免疫组化染色（×200）

表5 各组大鼠肾组织TGF-β1 AOD 值比较（x±s，n＝6）

3.6 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠肾组织TGF-β1、Smad2／3、FN 及ERK1／2 蛋白表达的影响 如图3 所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2／3、FN 及p-ERK1／2 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，缬沙坦组和益肾化湿颗粒各剂量组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2／3、FN 及p-ERK1／2 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与益肾化湿颗粒低剂量组比较，益肾化湿颗粒高剂量组和缬沙坦组大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2／3、FN 及p-ERK1／2 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 各组大鼠肾组织TGF-β1、FN、p-Smad2／3 及p-ERK1／2 蛋白表达（±s，n＝6）

3.7 益肾化湿颗粒对慢性MsPGN 大鼠肾组织TGF-β1、FNmRNA 表达的影响 如表6 所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1、FNmRNA 表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，缬沙坦组和益肾化湿颗粒各剂量组大鼠肾组织TGF-β1、FNmRNA 表达降低（P＜0.01）； 与益肾化湿颗粒低剂量组比较，益肾化湿颗粒高剂量组和缬沙坦组大鼠肾组织TGF-β1、FNmRNA 表降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 各组大鼠肾组织TGF-β1、FN mRNA 表达比较（x±s，n＝6）

4 讨论

随着肾脏病学及肾脏病理学的发展，MsPGN 的病因机制越来越明确，非特异性情况下不再被描述为一种特定的肾小球疾病，而是许多肾小球疾病（如IgA 肾病、Ⅱ型狼疮肾炎、感染后肾小球肾炎、IgM 肾病等）共通的病理损伤模式［15］。因此，对MsPGN 治疗策略的研究可为一众肾小球疾病的治疗提供参考和依据。

临床上，MsPGN 的基线治疗主要是血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂，有CKD 进展风险时加用糖皮质激素、免疫抑制剂等［16］，考虑到上述药物的局限性，越来越多的学者提倡中西医结合治疗慢性肾小球疾病。本研究结果显示，益肾化湿颗粒可降低抗Thy-1 肾炎大鼠蛋白尿，减轻肾小球系膜细胞增殖、ECM 积累、肾小球硬化和肾间质纤维化等病理改变，表明益肾化湿颗粒对MsPGN 大鼠具有保护作用。

蛋白质能量消耗在CKD 患者中很常见，会随着肾小球滤过率的降低而逐渐明显［17］。同时，肾脏病营养指南表明低水平的身体质量指数是CKD1-5 期非透析者及CKD5D 期维持性血透患者死亡率升高的因素之一［18］。益肾化湿颗粒在临床应用中表现出具有改善患者食欲的作用［19］。本研究发现，益肾化湿颗粒低、高剂量组大鼠体质量增长趋势较缬沙坦组、模型组明显，推测这与其降低大鼠蛋白尿、改善肾功并增加大鼠食欲相关，而增加体质量或许在一定程度上有助于延缓疾病进程。

越来越多的研究证实TGF-β1与肾脏纤维化关系密切［20］。在肾脏疾病中，TGF-β1激活经典的Smads 信号通路，在细胞核内调控促纤维分子的转录和翻译，诱导肌成纤维细胞激活和ECM 蛋白合成［21］。本研究发现，模型组大鼠肾组织TGF-β1表达升高，下游p-Smad2／3 亦呈上调趋势，免疫组化显示TGF-β1集中表达在肾小管上皮细胞和系膜区，提示TGF-β1／Samds 信号通路参与了慢性MsPGN 纤维化进程。从蛋白和基因层面发现，益肾化湿颗粒可抑制抗Thy-1 肾炎大鼠肾组织TGF-β1、p-Smad2／3、FN 的表达。此外，TGF-β1还可调控非经典信号通路，如磷脂酰肌醇-3激酶，丝裂原活化蛋白激酶家族等［22］，后者主要包括ERK1／2，p-38 和JNK［23］。ERK 信号通路的活化参与肾小球系膜细胞的增殖及ECM 沉积［24］，与肾脏纤维化密切相关［25］。有研究指出ERK 可磷酸化Smad2 和Smad3 连接子区域残基，调控Smad3 依赖的基因转录［26］，提示TGF-β1／Samds 与ERK1／2 之间存在环形信号交互。本研究发现，抗Thy-1 肾炎大鼠肾组织p-ERK1／2 表达升高，益肾化湿颗粒可抑制ERK 活化，提示益肾化湿颗粒可下调TGF-β1／Samds信号通路，抑制ERK1／2 磷酸化。

综上所述，益肾化湿颗粒可改善慢性抗Thy-1 肾炎大鼠蛋白尿，减轻系膜细胞增殖及细胞外基质积累，增加大鼠体质量，延缓肾功能进展，发挥肾保护作用，该作用可能与抑制TGF-β1／Smad2／3／ERK1／2 信号通路的活化相关。