炆远志炮制工艺优化及其成分与色泽相关性分析

宋金菊，钟凌云*，薛 晓*，解 杨，李家晴，王 卓，黄 艺，陈明霞，刘 斌，李育净

（1.江西中医药大学，江西 南昌 330004； 2.建昌帮药业有限公司，江西 抚州 344700）

远志为远志科植物远志Polygalatenuifolia或卵叶远志P.sibirica的干燥根，性温，味苦、辛，入心、肾、肺经，具益智安神、祛痰、消肿等作用［1］。远志的炮制方法主要有去心、甘草制、蜜炙和炆制等［2-3］，其中炆远志的特色炮制方法是将甘草与远志共同放入药罐中，加水后用糠火炆制，不仅可消除“戟人咽喉” 的副作用，还能增强其益智安神之功［3-6］。有学者发现，炆远志可减轻对大鼠胃肠功能的抑制作用［7］，提高心肾不交型失眠大鼠的记忆能力，且安神益智作用强于生品［8］。然而，评价炆远志质量完全靠老药工的经验，主观性强，难以有效控制，故本实验将炆远志的成分与色泽度相关联，建立更客观的评价方法。

本实验将Box-Behnken 响应面法和层次分析法（AHP）结合，进行炆远志炮制工艺的优化，再使用色差分析技术，将不同的炆远志样品粉末的外观颜色与内在成分相关联，研究分析炆远志的外观色泽与内在成分间的传递规律，为炆远志饮片在炮制过程中的质量监控提供数据支持，以便实现炆远志的规范化生产。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2965 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； SHZ-D （Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）； 111-B 二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）； Precision colorimetry SR-62 色差仪（深圳市三恩时科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 远志（产地山西，批号20200701，江西古汉精制中药饮片有限公司）、甘草（产地山西，批号20181224，江西旴江生态科技有限公司）分别经江西中医药大学龚千锋、葛菲教授鉴定为正品。细叶远志皂苷（批号CHB180329）、远志口山酮Ⅲ（批号CHB180913）、阿魏酸（批号CHB180206）、3，6′-二芥子酰基蔗糖 （批号CHB180429），均购于成都克洛玛生物科技有限公司。磷酸［阿拉丁试剂（上海）有限公司］。

2 方法与结果

2.1 炆远志制备 取1.5 cm 远志段100 g 和适量切制成斜片的生甘草，将两者放入炆药坛内，手动拌匀后，加入相应量的滑水或温水，盖好坛盖，放置于坛底两边以砖架起的围灶内，坛的四周用足量的干糠堆满，点火后炆制相应的时间［2，6，9］，至糠烬药熟、坛内汤水基本吸干为度，起坛倒出，拣去甘草段，烘箱干燥至手握即碎，即得。

2.2 醇浸出物的定量测定 选用2020 年版《中国药典》四部2201 （浸出物测定法）项下热浸法［2］。

2.3 各成分含量测定 采用HPLC 法。

2.3.1 色谱条件 参考文献 ［2］报道，采用Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

色谱条件1：流动相甲醇（A）-0.05%磷酸（70 ∶30）；体积流量1.0 mL／min； 检测波长210 nm； 柱温35 ℃； 进样量10 μL。色谱图见图1。

图1 对照品（A）、供试品（B）溶液HPLC 色谱图（Ⅰ）

色谱条件2：流动相乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～20 min，18% A； 20 ～60 min，18% ～24% A）；体积流量1.0 mL／min； 柱温35 ℃； 检测波长320 nm； 进样量20 μL。色谱图见图2。

图2 对照品（A）、供试品（B）溶液HPLC 色谱图（Ⅱ）

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于棕色量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，超声处理5 min，即得（远志口山酮Ⅲ、阿魏酸、细叶远志皂苷、3，6′-二芥子酰基蔗糖质量浓度分别为0.28、0.11、1.006 6、0.312 5 mg／mL），在4 ℃下保存。

2.3.3 供试品溶液制备 供试品溶液1：精密称定过3 号筛的炆远志粉末约1 g，后续选用远志中细叶远志皂苷测定含量方法，与2020 年版《中国药典》 方法［2］一致。

供试品溶液2：与崔月莉等［10］报道一致，不同之处在于溶剂为70%甲醇，0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 线性关系考察 取“2.3.2” 项下细叶远志皂苷对照品溶液适量，甲醇稀释2、4、8、10、16、20 倍，配制质量浓度分别为 1.006 6、0.503 3、0.251 65、0.125 825、0.100 66、0.062 912 5、0.050 33 mg／mL 的溶液，在“2.3.1” 项色谱条件1 下进样测定。

精密吸取“2.3.2” 项下阿魏酸、远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖对照品溶液适量，甲醇将阿魏酸稀释40、80、160、320、400 倍，分别制成质量浓度为0.11、0.002 75、0.001 375、0.000 687 5、0.000 343 75、0.000 275 mg／mL 的溶液； 将远志口山酮Ⅲ稀释2、4、8、10、16 倍，分别制成质量浓度为0.28、0.14、0.07、0.035、0.028、0.017 5 mg／mL 的溶液； 将3，6′-二芥子酰基蔗糖稀释2、4、8、10、16 倍，分别制成质量浓度为0.312 5、0.156 25、0.078 125、0.039 062 5、0.031 25、0.019 531 25 mg／mL 的溶液，在“2.3.1” 项色谱条件2 下进样测定。

以各成分峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.3.4.2 精密度试验 精密吸取细叶远志皂苷对照品溶液10 μL，在“2.3.1” 项色谱条件1 下进样测定6 次，分别精密吸取另外3 个对照品溶液20 μL，在“2.3.1” 项色谱条件2 下进样测定6 次，测得细叶远志皂苷、阿魏酸、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志口山酮Ⅲ峰面积RSD 分别为0.67%、0.32%、0.52%、0.19%，表明仪器精密度良好。

2.3.4.3 稳定性试验 精密吸取10 μL “2.3.3” 项下供试品溶液1，在“2.3.1” 项色谱条件1 下进样测定； 精密吸取20 μL “2.3.3” 项下的供试品溶液2，在“2.3.1” 项色谱条件2 下进样测定，时间点均为0、2、4、8、16、24 h，测得细叶远志皂苷、阿魏酸、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志口山酮Ⅲ峰面积RSD 分别为2.21%、0.92%、0.26%、1.18%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.4.4 重复性试验 精密称取同一批炆远志粉末6 份，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液1、2，分别在“2.3.1” 项色谱条件1、2 下进样测定，测得细叶远志皂苷、阿魏酸、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志口山酮Ⅲ含量RSD 分别为2.14%、1.34%、0.31%、0.85%，表明该方法重复性良好。

2.3.4.5 加样回收率试验 精密吸取“2.3.3” 项下各成分含量已知的供试品溶液1、2 各0.5 mL，平行6 份，置于具塞锥形瓶中，供试品溶液1 中加入“2.3.2” 项下细叶远志皂苷对照品溶液适量，在“2.3.1” 项色谱条件1 下进样测定； 供试品溶液2 中加入“2.3.2” 项下阿魏酸、远志口山酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖对照品溶液适量，在“2.3.1” 项色谱条件2 下进样测定，计算回收率。结果，各成分平均加样回收率分别为细叶远志皂苷103.56%、阿魏酸0.62%、远志口山酮Ⅲ0.52%、3，6′-二芥子酰基蔗糖2.10%。

2.4 指标成分权重确定

2.4.1 AHP 法 基于醇浸出物、细叶远志皂苷、远志口山酮Ⅲ和3，6′-二芥子酰基蔗糖作为2020 年版《中国药典》远志质量控制的关键性指标，阿魏酸为远志炆制后含量会上升的小分子酸［10］，并且具有改善学习记忆障碍和神经保护作用［11-12］，故将其纳入为评价炆远志炮制工艺的关键指标范畴。将这5 个指标分为5 个层次，建立炆远志炮制工艺评价层次结构模型，以含量多少和指向性明确为标准，醇浸出物指向性最低，故层级占比最小； 阿魏酸指向性强但含量最低，层级占比高于醇浸出物； 而细叶远志皂苷含量虽高，但提取方法和液相方法不同于其他指标成分，所以确定指标的重要性排序为3，6′-二芥子酰基蔗糖＞远志口山酮Ⅲ＞细叶远志皂苷＞阿魏酸＞醇浸出物。两两比较重要性按照1～9 的相对评分规则进行，评分标准见表2，成分成对比较优先判断矩阵及权重系数见表3，可知CR＝0.095 7＜0.1，矩阵符合一致性检验［13-14］，表明能在炆远志炮制工艺的优化评分中应用该权重系数。

表2 各层级评分标准

表3 各指标成对比较优先判断矩阵及其权重系数

2.4.2 综合评分（OD）计算 公式为OD ＝（W1×Y1／Y1max＋W2×Y2／Y2max＋W3×Y3／Y3max＋W4×Y4／Y4max＋W5×Y5／Y5max）×100%，其中Y1、Y2、Y3、Y4、Y5分别为远志口山酮Ⅲ、阿魏酸、细叶远志皂苷、3，6′-二芥子酰基蔗糖、醇浸出物含量，Y1max、Y2max、Y3max、Y4max、Y5max分别为对应的最大值［14］。

2.5 Box-Bohnken 响应面法 参考文献［15］报道和课题组前期研究［2］，以加水量（A）、甘草用量（B）、干燥温度（C）为影响因素，远志口山酮Ⅲ（Y1）、阿魏酸（Y2）、细叶远志皂苷（Y3）、3，6′-二芥子酰基蔗糖（Y4）、醇浸出物（Y5）含量的综合评分（OD）为评价指标，因素水平见表4，结果见表5。

表4 因素水平

表5 试验设计与结果

通过Design-Expert 8.06 软件对表5 数据进行拟合，得方程为OD＝90.29-1.44A＋2.21B＋4.11C＋2.58AB＋1.61AC-1.14BC-2.18A2＋1.06B2-4.91C2，方差分析见表6。由此可知，模型F＝4.16，P＝0.036 8 ＜0.05； 失拟项F＝0.75，P＝0.578 4＞0.05，可见模型具有高度显著性，可用于预测分析； 一次项显著性依次为C＞B＞A，二次项显著性依次为C2＞A2＞B2，交互项无显著性； 因素C影响极显著 （P＜0.01），C2影响显著（P＜0.05）。

表6 方差分析

响应面分析见图3。最终确定，最优工艺为每100 g 1.5 cm 远志段加5 倍量水、7 g 甘草，干燥温度70 ℃。

图3 加水量（A）、甘草用量（B）、干燥温度（C）响应面图

2.6 验证试验 称取1.5 cm 的远志段100 g，平行3 份，按“2.5” 项下优化工艺进行炮制，测得综合评分分别为89.16、88.87、89.90 分，表明该工艺稳定可行。

2.7 色度值测定 采用Precision colorimetry SR-62 色差仪，设置测定条件为D65 光源，孔径4 mm，SCE 模式，对仪器进行黑白板校正。该模式下L、a、b 代表各个炮制品的色度值，Eab 为总色度值，其中L 为明亮度，a 和b 分别调控2 个色调方向，L 值越大，明亮度越高，表现为越白，反之越黑； a 调控红色和绿色，＋a 表示与a 值呈正相关，调控红色，-a 表示与a 值呈负相关，调控绿色； b 调控黄色和蓝色，＋b 表示与b 值呈正相关，调控黄色，-b 表示与b 值呈负相关，调控蓝色［16-18］。

先取与“2.5.1” 项下炆远志同批次的生品粉末进行标样测定，再取“2.5.1” 项下17 组炆远志粉末作为供试品依次测定，平行3 次，取平均值，结果见表7。远志生品中，各成分含量分别为远志口山酮Ⅲ3.339 2 mg／g、阿魏酸0.035 3 mg／g、细叶远志皂苷26.842 3 mg／g、3，6′-二芥子酰基蔗糖7.585 9 mg／g、醇浸出物含量44.800 0 g／g。

表7 生远志、炆远志L、a、b 值

2.8 相关性分析 根据炆远志不同炮制品中色度值L、a、b 值和5 个指标的含量制作相应的变化趋势图，将两者进行关联性分析［19］，结果见图5～6、表8。

表8 成分含量秩检验相关性分析

图5 色度值、成分含量变化趋势

图6 成分含量与色度值相关性热图

结果显示，炆远志成分含量的高低影响着色泽的变化，其关联性表现为醇浸出物和远志口山酮Ⅲ含量调控亮度和绿色，含量越高越亮白、越绿； 阿魏酸含量调控黑色和红色，阿魏酸含量越高越黑、越红； 醇浸出物和远志口山酮Ⅲ含量越高，Eab 值越大； 阿魏酸含量越高，Eab 值越小。虽然由表7 的相关性分析数据可知，b 值各个指标之间的相关性没有显著性，但远志生品的外观为黄棕色，与b 值关系密切，故做进一步的分析。结果，b 值与细叶远志皂苷、3，6′-二芥子酰基蔗糖和醇浸出物含量呈正相关，与阿魏酸和远志口山酮Ⅲ含量呈负相关。由表4 可知，1 g 炆远志中各成分含量依次为醇浸出物＞细叶远志皂苷＞3，6′-二芥子酰基蔗糖＞远志口山酮Ⅲ＞阿魏酸； 远志炆制后，醇浸出物、3，6′-二芥子酰基蔗糖、远志口山酮Ⅲ含量有不同程度的下降，阿魏酸含量有所上升，表明炆远志的外观色泽度变化与其内在指标成分含量的变化具有一致性，可通过将直观的饮片外观颜色与内在的成分相关联，作为鉴定饮片质量的新方法。

3 讨论与结论

本研究以《建昌帮中药传统炮制法》 和2008 年版《江西省中药饮片炮制规范》 为基础，选择5 种关键成分作为评价指标，采用响应面法对影响炆远志饮片质量的3 个因素进行优化，探究能否通过改变炆远志炮制过程中的加水量、甘草用量和干燥温度来把控饮片生产过程中的质量。实验数据显示，炮制工艺因素对炆远志影响程度由大到小排序为干燥温度＞甘草用量＞加水量，其中干燥温度对远志炆制工艺具有显著差异（P＜0.05），最终确定最优炆制工艺为100 g 远志加5 倍水、7 g 甘草，干燥温度70 ℃。

中药饮片的质量评价主要由外观性状和内在质量综合确定，本研究将表面颜色与内在成分进行关联分析［20］增加外观颜色来判定炆远志饮片炮制程度［21］，进而把控其饮片质量。传统经验认为，远志主要以筒粗、肉厚、去净木心为佳［22］，但由于远志炆制后，肉眼难以辨别外观性状的差异。因此，本实验采用色差仪对炆远志粉末的表面颜色进行数据分析，结果表明炆远志饮片外观颜色受醇浸出物、远志口山酮Ⅲ和阿魏酸含量影响，醇浸出物和远志口山酮Ⅲ含量越高，越亮绿，反之越黑红； 阿魏酸含量越高，越黑红，反之越亮绿。研究数据表明，与生品相比，远志炆制后醇浸出物和远志口山酮Ⅲ含量降低，阿魏酸含量升高，表面颜色变化趋向黑红，与内在指标成分含量的变化具有一致性。