当归藤总黄酮超声提取工艺优化

姜鹏程，陆晔晗，常芮宁，宋 艺，王艾雯，王春丽*，郭美珠，张春芳

（1.华东理工大学药学院，上海市新药设计重点实验室，制药工程与过程化学教育部工程研究中心，上海 200030； 2.上海市宝山区中西医结合医院，上海 201999； 3.厦门大学附属翔安医院，福建 厦门 361005）

当归藤EmbeliaparvifloraWall.ex A.DC.又名小花酸藤子，为攀援灌木或藤本，具有活血化瘀、补肾强腰、调经助阳等功效，民间常用于血瘀证、跌打骨折、腰腿酸痛、月经不调、产后虚弱等病症，也可用于风湿免疫病、心痛或胃痛等［1-2］。现代药理研究发现，当归藤在促进血液循环、抗凝血、抗炎镇痛方面具有一定疗效［3-4］。目前，从当归藤中提取出的化学成分包含黄酮类、萜类、甾体类等［5］，但对当归藤总黄酮提取工艺优化的研究尚少，本实验利用Plackett-Burman 法和Box-Behnken 响应面法，探索其最佳超声提取工艺。

1 材料

1.1 试剂与药物 当归藤购于广西中药材养生堂，经华东理工大学药学院马磊教授鉴定为紫金牛科酸藤子属植物当归藤EmbeliaparvifloraWall.ex A.DC.的根与老茎。芦丁对照品（上海笛柏生物科技有限公司，批号H355003）。硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（上海沃化化工有限公司）。

1.2 仪器 FA2004 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）； UV-754N 紫外分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）； SHZ-DⅢ循环水真空泵（上海予华仪器设备有限公司）； RE-52AA 旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司）； DLF-18 流水式中药粉碎机（温州顶历医疗器械有限公司）； KQ-300DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 供试品溶液制备 当归藤置于50 ℃烘箱中烘干，粉碎过筛，分装于密封袋中，阴凉处备用。称取2 g 当归藤粉末，按料液比1 ∶30 加入60 mL 50%乙醇，60 ℃下超声提取30 min，抽滤，浓缩除去乙醇，加水溶解定容至10 mL，即得。

2.1.2 对照品溶液制备 60% 乙醇溶解10 mg 芦丁对照品，定容至50 mL，即得0.2 mg／mL 溶液。

2.1.3 测定方法 参考文献［6-8］报道，取供试品、对照品溶液适量，加入5% NaNO2溶液0.4 mL，摇匀后静置6 min，再加入10% Al （NO3）3溶液0.4 mL，摇匀后静置6 min，最后加入4% NaOH 溶液4.0 mL，60% 乙醇定容。以纯加试剂为空白对照，在510 nm 波长处检测吸光度（A），测定总黄酮含量。

2.1.4 线性关系考察 分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 对照品溶液，置于10 mL 量瓶中，按“2.1.3” 项下方法测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.007 5X＋0.043 9 （R2＝0.999 3），在4～24 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取对照品溶液6 份，显色后按“2.1.3” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为2.63%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 精密称取当归藤粉末2 g，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，显色后于0、10、20、30、40、50、60 min 按“2.1.3” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为1.48%，表明溶液在60 min 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取“2.1.1” 项下供试品溶液6 份，显色后按“2.1.3” 项下方法测定吸光度，测得其RSD 为4.36%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 按“2.1.7” 项下方法测得供试品溶液中黄酮含量为18.146 μg／mL，取1 mL 供试品溶液，加入18 μg 对照品，共6 份，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，显色后按“2.1.3” 项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，芦丁平均加样回收率为99.51%，RSD为1.98%。

2.2 单因素试验 本实验对不同乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%）、料液比（1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40）、超声功率 （180、210、240、270、300 W）、超声温度（30、40、50、60、70 ℃）、超声时间（20、30、40、50、60 min）进行考察，研究其对总黄酮得率的影响。

2.2.1 乙醇体积分数 称取2 g 当归藤粉末，按料液比1 ∶30分别加入30%、40%、50%、60%、70%乙醇，60 ℃水浴中180 W 超声提取30 min，制成生药量2 mg／mL 的供试品溶液，测定总黄酮得率。由图1 可知，总黄酮得率随着乙醇体积分数增加呈现先升高后降低的趋势，在60%时达到最大值，可能的原因是大多数总黄酮类化合物呈弱极性或非极性，随着乙醇体积分数的增加，溶剂极性减弱，对总黄酮得率产生一定影响［9］。因此，适宜当归藤总黄酮提取的乙醇体积分数为60%。

图1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

2.2.2 料液比 称取2 g 当归藤粉末，分别按料液比1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40 加入60%乙醇，60 ℃水浴中180 W 超声提取30 min，制成生药量2 mg／mL 的供试品溶液，测定总黄酮得率。由图2 可知，总黄酮得率随着料液比增加呈现先升高后降低，总体下降的趋势，在1 ∶25 时达到最大值，可能原因是料液比过低时，溶剂无法充分浸润药材，造成总黄酮得率有所损失，而当归藤总黄酮含量有最大值，料液比增加，总黄酮溶解量不变，杂质溶出量增大，造成总黄酮得率降低； 较高的料液比会削弱空化效应释放的能量，并且能量被溶液的过量体积吸收和损失，导致总黄酮得率降低［10］。因此，适宜当归藤总黄酮提取的料液比为1 ∶25。

图2 料液比对总黄酮得率的影响

2.2.3 超声功率 称取2 g 当归藤粉末，按料液比1 ∶25加入60%乙醇，60 ℃水浴中分别以180、210、240、270、300 W 功率超声提取30 min，制成生药量2 mg／mL 的供试品溶液，测定总黄酮得率。由图3 可知，总黄酮得率随着超声功率增加呈现先升高后降低的趋势，在240 W 时达到最大值，可能原因是超声波处理的提取物中活性成分含量增加是由于超声波辐射压力引起的机械振动，加速溶剂渗透，然而功率过大会升高温度，高温导致气蚀现象减少，这是蒸汽压增加以及溶剂黏度和表面张力降低的结果，从而降低提取率［11］。因此，适宜当归藤总黄酮提取的超声功率为240 W。

图3 超声功率对总黄酮得率的影响

2.2.4 超声温度 称取2 g 当归藤粉末，按料液比1 ∶25加入60% 乙醇，分别在30、40、50、60、70 ℃水浴中240 W超声提取30 min，制成生药量2 mg／mL 的供试品溶液，测定总黄酮得率。由图4 可知，总黄酮得率随着超声温度增加呈现先升高后降低，再次升高的趋势，在50 ℃时达到最大值，可能原因是在低温时升高温度，溶液黏度下降，分子运动加快，扩散性增强，有利于总黄酮类化合物溶出，继续升高温度使得其他杂质溶出，总黄酮得率下降。因此，适宜当归藤总黄酮提取的超声温度为50 ℃。

图4 超声温度对总黄酮得率的影响

2.2.5 超声时间 称取2 g 当归藤粉末，按料液比1 ∶25加入60%乙醇，50 ℃水浴中240 W 分别超声提取20、30、40、50、60 min，制成生药量2 mg／mL 的供试品溶液，测定总黄酮得率。由图5 可知，总黄酮得率随着超声时间增加呈现先升高后降低的趋势，在40 min 时达到最大值，可能原因是提取时间过短，总黄酮类化合物未充分溶出，总黄酮得率此时较低； 提取时间过长，使总黄酮的结构遭到一定损坏，杂质的溶出量也会有一定增加，进一步使得总黄酮得率下降［12］。因此，适宜当归藤总黄酮提取的超声时间为40 min。

图5 超声时间对总黄酮得率的影响

2.3 Plackett-Burman 法 Plackett-Burman 法能以较少的实验次数对众多因素进行快速筛选，得到显著影响因素［13］。本研究选择超声时间（A）、料液比（B）、乙醇体积分数（C）、超声功率（D）、超声温度（E）作为影响因素，总黄酮得率（Y）作为评价指标，设计五因素二水平共12 个试验点进行筛选，因素水平见表1，结果见表2。

表1 Plackett-Burman 试验因素水平

表2 Plackett-Burman 试验设计与结果

通过Design-Expert 8.0.6.1 软件对表2 数据进行方差分析，结果见表3。由此可知，超声时间（A）、超声功率（D）、超声温度 （E）对总黄酮得率有显著影响 （P＜0.05），影响程度依次为超声温度＞超声时间＞超声功率，其余2 个因素影响不显著，故选择超声时间、超声功率、超声温度作进一步响应面分析。

表3 Plackett-Burman 试验方差分析

2.4 Box-Behnken 响应面法 在Plackett-Burman 法基础上，选择超声时间（X1）、超声功率（X2）、超声温度（X3）作为影响因素，总黄酮得率（Y）作为评价指标，设计三因素三水平共17 个试验点作进一步优化，因素水平见表4，结果见表5。

表4 Box-Behnken 响应面法因素水平

表5 Box-Behnken 响应面法设计与结果

通过Design Expert 8.0.6.1 软件对表5 数据进行回归拟合，得方程为Y＝12.62＋0.072X1-0.33X2＋0.14X3-0.19X1X2-0.22X1X3-0.078X2X3-0.81-0.82-0.61。

对所得模型进行显著性检验［14-17］，结果见表6。由此可知，模型P＜0.000 1，具有高度显著性； 失拟项P＝0.648 1 （P＞0.05），表明失拟不够显著； 模型相关系数R2为0.988 8，调整后相关系数Radj2为0.974 4，即该模型与实际试验的拟合程度良好，可用于对当归藤总黄酮的提取进行分析和预测； 超声功率（X2）、超声温度（X3）P＜0.05，表明影响显著； 交互项中X1X2、X1X3、X12、X22、均有显著影响，X2X3项交互作用不明显，影响较不显著，表明不同提取工艺与当归藤总黄酮得率之间不是单纯的线性关系； 根据F值大小（X2＞X3＞X1），各因素影响程度依次为超声功率＞超声温度＞超声时间。

表6 Box-Behnken 响应面法方差分析

响应面分析见图6，可知超声时间与超声温度的响应面斜面最陡，等高线呈椭圆形，P值为0.008 7 （P＜0.01），表明两者的交互作用极明显，达到极显著水平； 超声时间与超声功率的斜面较陡，P值为0.018 3 （P＜0.05），表明两者的交互作用较明显，达到较显著水平； 超声功率与超声温度的斜面较平坦，等高线图偏圆，P值为0.247 8 （P＞0.1），两者交互作用不显著，影响较小。

图6 各因素响应面图

最终确定，最优提取条件为超声时间40.54 min，超声功率233.53 W，超声温度51.18 ℃，总黄酮得率为12.67%，结合实际情况，将其修正为超声时间40 min，超声功率240 W，超声温度50 ℃，乙醇体积分数60%，料液比1 ∶25。按上述条件进行验证试验，测得总黄酮平均得率为12.59%，与理论值12.67%相差0.08%，说明此模型的预测较为良好稳定，可用于当归藤总黄酮的提取。

3 讨论与结论

作为民间喜用、各科常用的藤类中药，当归藤相关研究较少，有效成分分析也不够明确。本研究在当归藤总黄酮的提取中运用超声提取法，相较于中药传统提取工艺，具有时间短、效率高、绿色且经济的优点，但过久的超声时间，过大的功率，以及不合适的温度、料液比、溶剂浓度都会对提取率存在不利影响，因此需要对各因素进行探究［18-19］。本研究以单因素试验作为基础，利用Plackett-Burman 试验设计从5 个因素中筛选影响较大的3 个，再通过Box-Behnken 响应面试验优化，得到最优工艺为乙醇体积分数60%，料液比1 ∶25，超声功率240 W，超声温度50 ℃，超声时间40 min，总黄酮平均得率为12.59%。Plackett-Burman 试验和响应面试验显示，此方法重复性良好，有助于当归藤的进一步开发利用。

在研究料液比对总黄酮得率的影响时发现，得率在达最高后随料液比的增加逐步降低，然而料液比增加到1 ∶35 时又出现升高趋势，料液比再增加后，总黄酮提取率又下降，其原因可能是影响得率的因素较复杂，呈现出的结果由多个因素作用而影响，此时积极因素大于消极因素，呈现略升高趋势。随液料比增加，导致黄酮得率上升的积极因素有逐渐增加提取溶剂的体积有利于扩大样品与提取溶剂的接触面积，更有利于样品中总黄酮溶出［20］。消极因素有随料液比的增加，溶出的黄酮也会被复溶，或有杂质溶出，导致总黄酮得率降低。推测在料液比为1 ∶35 时与溶剂的接触面积较1 ∶30 时大，受复溶及杂质的影响较1 ∶40 时小，所以呈现升高趋势。然而具体影响因素以及作用方式有待进一步研究。