昆葵保肾颗粒提取工艺优化

田明鑫，倪昌荣，周洪亮，余江毅*

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210029）

糖尿病肾病是糖尿病导致终末期肾脏病、心血管死亡的主要原因之一［1-2］，本病发病初期较隐匿，至中后期出现大量蛋白尿、肾功能衰竭等［3-4］。昆葵保肾方为江苏省名中医余江毅教授临床经验方，由黄蜀葵花、火把花根、黄芪、酒萸肉组成，具有减轻蛋白尿、保护肾功能、逆转糖尿病肾病等作用，但本方还停留在临床应用阶段，无法大规模生产，故将其开发成医疗机构制剂。

目前，中药提取工艺研究以选择指标成分含量较高的工艺参数为主，并未与临床汤剂进行比较，后者经多年临床应用证实了其安全性、有效性，但一味地追求某一含量较高的工艺参数则忽略了中药多成分之间的协同作用，并且往往采用砂锅、陶罐进行煎煮，其工艺参数无法直接应用于多功能提取罐等工业化生产设备，故实现现代提取工艺与传统制法的质量一致性是中药制剂开发的关键［5-8］。本实验采用Box-Behnken 响应面法优化昆葵保肾颗粒提取工艺，以期为该制剂研发提供参考依据、技术支持。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； BP-211D 电子分析天平 （德国赛多利斯公司）；SK6200H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）； HH-6 数显恒温水浴锅（常州国华仪器制造有限公司）。

1.2 试剂与药物 所有对照品均购于南京聚康医药化工有限公司，纯度均≥98%，其中金丝桃苷批号220522，异槲皮苷批号220317，棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷批号220421，表儿茶素批号220421，毛蕊异黄酮批号220405，毛蕊异黄酮葡萄糖苷批号220509，芒柄花苷批号220314，芒柄花黄素批号220314，莫诺苷批号220510，马钱苷批号220412。黄蜀葵花 （批号220805，产地安徽）、酒萸肉（批号220801，产地河南）均购于马鞍山井泉中药饮片有限公司，火把花根（批号20220901-01，产地云南）、黄芪（批号20220801-01，产地甘肃）均购于贵州同德药业股份有限公司，经南京中医药大学附属医院主任中药师刘志辉鉴定为正品，符合2020 年版《中国药典》 及地方标准要求。乙腈为色谱纯（美国Tedia 公司）； 其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 临床汤剂制备 依据《医疗机构中药煎药室管理规范》［9］及江苏省中医院草药煎服须知，按处方比例称取黄蜀葵花30 g、火把花根15 g、黄芪30 g、酒萸肉10 g，第一煎加水超过液面3～5 cm，浸泡30 min，煮沸后小火煎煮30 min； 第二煎加水至药面，煮沸后小火煎煮20 min，纱布趁热过滤，合并2 次煎液，混匀，即得。

2.2 指标成分含量测定 采用HPLC 法。

2.2.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）； 流动相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～5 min，7%A； 5 ～22 min，7% ～17%A； 22 ～40 min，17% A； 40 ～55 min，17% ～60% A； 55 ～60 min，60% ～80%A； 60～70 min，80%A）； 体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃； 检测波长240 nm； 进样量10 μL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容，得到金丝桃苷、异槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、表儿茶素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花黄素、莫诺苷、马钱苷对照品质量浓度分别为0.404、0.400、0.350、0.396、0.411、0.354、0.406、0.407、0.400、0.405 mg／mL 的贮备液，分别精密吸取适量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇定容，即得 （各成分质量浓度分别为27.742、15.520、34.645、6.178、0.122、2.195、0.811、0.070、15.185、8.347 μg／mL）。

2.2.3 供试品溶液制备 取临床汤剂、各试验号样品各1 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.4 系统适用性试验 取供试品、对照品溶液适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，对照品、供试品溶液在同一保留时间内有对应成分色谱峰，并且与相邻峰之间的分离度较好（均大于1.5），表明该方法系统适用性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.2.5 线性关系考察 取“2.2.2” 项下对照品溶液适量，甲醇依次稀释成6 个质量浓度，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.2.6 精密度试验 取“2.2.3” 项下临床汤剂适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得莫诺苷、马钱苷、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素峰面积RSD 分别为1.40%、0.37%、1.94%、0.96%、0.36%、0.37%、0.30%、1.16%、2.02%、2.34%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取“2.2.3” 项下临床汤剂适量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素峰面积RSD 分别为

2.15%、1.06%、2.03%、0.67%、0.84%、1.65%、1.09%、1.02%、2.81%、2.52%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。2.2.8 重复性试验 按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得莫诺苷、马钱苷、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素峰面积RSD 分别为2.17%、1.13%、1.83%、1.33%、0.93%、1.77%、1.58%、1.29%、2.11%、2.36%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取临床汤剂0.5 mL，共6 份，按100%水平加入对照品，按“2.2.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，莫诺苷、马钱苷、表儿茶素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、金丝桃苷、异槲皮苷、棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素平均加样回收率分别为96.69%、96.18%、100.33%、99.63%、104.46%、100.79%、102.97%、100.23%、100.92%、100.10%，RSD 分别为2.42%、1.37%、2.18%、2.42%、1.49%、1.92%、2.02%、2.51%、2.29%、2.24%。

2.3 干膏率测定 取适量提取液至蒸发皿中，水浴蒸干，置于105 ℃烘箱中干燥3 h 至恒重，再放到干燥器中冷却30 min，精密称定质量，计算干膏率，公式为干膏率＝ ［（浸膏质量×样品总体积）／ （饮片质量×取样量）］×100%。

2.4 提取工艺优化

2.4.1 单因素试验 影响提取效果的主要因素包括加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数［10］，其中提取次数为非连续变量，不宜作为Box-Behnken 响应面法优化的考察因素，故根据实际生产情况固定为2 次［11］。本实验以加水量（6、8、10、12 倍）、浸泡时间（0、20、40、60 min）、提取时间（30、45、60、75 min）为影响因素进行单因素试验，测定各指标成分含量、干膏率，计算其综合评分，其中为第n（n＝1，2，3，…，17）个试验样品的i指标（指标成分含量、干膏率）与X实验组i指标的比值，结果见图2。由此可知，随着加水量增加综合评分呈升高趋势，10 倍后趋于平缓，故以10 倍量水为中心点； 随着浸泡、提取时间延长综合评分呈升高-平缓-降低的趋势，从实际生产中的节能省时角度出发，以20 min 为浸泡时间中心点，45 min 为提取时间中心点。

图2 加水量（A）、浸泡时间（B）、提取时间（C）单因素试验结果

2.4.2 Box-Behnken 响应面法 在单因素试验基础上，固定提取次数2 次，以加水量（A）、提取时间（B）、浸泡时间（C）为影响因素，综合评分（M）为评价指标，采用Design-Expert 13.0 软件建立三因素三水平试验［12］，因素水平见表2，结果见表3。

表2 因素水平

表3 试验设计与结果

将表3 数据导入Design-Expert 12.0 软件进行多元二次回归拟合，得方程为M＝1.430 0-0.049 9A-0.139 3B-0.008 4C-0.103 7AB-0.054 0AC＋0.255 7BC-0.598 7A2-0.323 9B2-0.563 2C2（R2＝0.985 6），方差分析见表4。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 失拟项P＞0.05，表明模型拟合度较高，误差较小，可用于预测分析； 因素B、BC、A2、B2、C2有显著或极显著影响（P＜0.05，P＜0.01）。

响应面分析见图3。由此可知，沿B 轴的坡度与沿A轴的相比较陡，表明提取时间对综合评分的影响比加水量大； 沿A 轴的坡度略陡于沿C 轴的，表明与浸泡时间相比加水量对综合评分的影响稍大； 沿B 轴的坡度大于沿C 轴的，表明提取时间对综合评分的影响大于浸泡时间，与方差分析结果一致。采用Design-Expert 12.0 软件，得到最优工艺为加水量9.96 倍，煎煮时间41.46 min，浸泡时间18.80 min，结合实际生产需求，将其修正为加水量10 倍，煎煮时间40 min，浸泡时间20 min，综合评分为1.447 分。

图3 各因素响应面图

2.5 验证试验 按“2.4” 项下优化工艺制备3 批样品，进行验证试验，结果见表5。由此可知，平均综合评分为1.452 分，与预测值（1.447 分）接近（相对误差＜1.0%），表明该工艺稳定可靠，模型预测性良好。

表5 验证试验结果（n＝3）

3 讨论

本实验通过前期文献调研及网络药理学研究，明确了昆葵保肾颗粒中10 种与糖尿病肾病密切相关的指标成分，其中黄蜀葵花中棉花皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、金丝桃苷、异槲皮苷可通过抑制NADPH／ROS／ERK 信号通路来改善大鼠肾小管间质纤维化［13-14］； 王丽娟等［15］研究表明，火把花根片可升高HGF 水平，下调TGF-β1 水平； 黄芪中毛蕊异黄酮可显著下调DKD 小鼠肾组织中TNF-α、IL-1β 表达；芒柄花黄素可增加T2DM 大鼠肾组织SIRT1 表达，减轻肾脏损害［16-17］； 沈红胜等［18-19］发现，马钱苷、莫诺苷可降低RAGE 蛋白表达，抑制NF-κB 表达。然后，采用DAD 检测器进行200～400 nm 全波长扫描，考察各成分色谱峰数目、峰形、分离度等参数，发现它们在240 nm 左右均有较好吸收，并且峰形较好，故选择240 nm 作为检测波长。

Box-Behnken 响应面法将体系的响应作为一个或多个因素的函数，通过图形技术显示函数关系，可直观选择试验设计中的最佳条件［20-21］。目前，采用响应面法考察中药复方提取工艺时选取的指标较少，难以反映中药多成分内在本质。本实验将各成分含量及干膏率共同纳入综合评分，更能反映中药多成分相互协同发挥药效的内在本质。

4 结论

目前，对中药提取工艺的研究大多采用均匀设计、正交设计等方法，对浸泡时间、提取时间等参数进行多因素、多水平分析，从而优化指标成分较多的工艺，虽然能增加提取效率，但难以保证临床汤剂与制剂质量的一致性及临床使用的安全性、有效性。本实验优化昆葵保肾颗粒提取工艺，可最大程度地与临床汤剂昆葵保肾方保持一致，并且所用的Box-Behnken 响应面法稳定可行，重复性良好，可为该制剂进一步研发提供参考依据、技术支持，也能为后续其他医疗机构中药制剂提取工艺优化提供思路。