HPLC-MS／MS 法同时测定荆防颗粒中10 种成分

2024-01-29郑振秋巩长芹官玉静

中成药 2023年12期

郑振秋，巩长芹，张雪，孙倩，官玉静

（临沂市检验检测中心，山东临沂 276000）

荆防颗粒由荆芥、防风、独活、羌活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗、甘草11 味中药组成，源自《摄生众妙方》中的荆防败毒散［1］，具有发汗解表、散风祛湿的功效，主要用于治疗感冒风寒、头痛身痛、恶寒无汗、鼻塞流涕、咳嗽［2］。该制剂质量标准收载于《卫生部药品标准（中药成方制剂第二册）》，但只有性状项、颗粒剂检查项，缺乏对有效成分的控制。目前，已有文献［3-7］对荆防颗粒中部分成分进行定性、定量分析，但尚未涉及多成分。

HPLC-MS／MS 法具有选择性强、灵敏度高等优势［8］，已广泛应用于中药及其复方制剂所含成分的分析［9-19］。因此，本实验根据2020 年版《中国药典》一部［20］要求，采用该方法同时测定荆防颗粒中胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二氢欧山芹醇当归酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

Triple QuadTM4500 超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、ESI 离子源、Analyst software 仪器操作软件、SCIEX OS 数据处理软件（美国AB Sciex 公司）；XS205 电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ-300DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

胡薄荷酮（批号 111706-201907，纯度99.8%）、升麻素苷（批号111522-201913，纯度94.6%）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201811，纯度97.4%）、二氢欧山芹醇当归酸酯（批号111583-202006，纯度98.9%）、阿魏酸（批号110773-201915，纯度99.4%）、柴胡皂苷a （批号110777-201912，纯度94.8%）、柴胡皂苷d （批号110778-201912，纯度96.3%）、柚皮苷（批号110722-202116，纯度93.5%）、甘草苷（批号111610-201908，纯度95.0%）、甘草酸铵（批号110731-202122，纯度94.4%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（德国默克公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。荆防颗粒共4 批（批号 2782103006、20210507、211108、0012002015），由不同厂家生产，均为市售。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液精密称取各对照品适量，甲醇溶解，制成贮备液（胡薄荷酮、二氢欧山芹醇当归酸酯质量浓度均约为1 μg／mL，柚皮苷质量浓度约为100 μg／mL，其余对照品质量浓度均约为10 μg／mL），分别精密量取1、5、10、100、500 μL 及1、2、5、10 mL，置于100 mL 量瓶中，20%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液取本品适量，研细，取约10 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，精密量取上清液1 mL，置于10 mL 量瓶中，20%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

2.2 色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流动相甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0 ～2 min，95% B；2～13 min，95% ～5% B； 13 ～18 min，5% B；18～18.1 min，5% ～95%B； 18.1 ～25 min，95%B）；体积流量0.3 mL／min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.3 质谱条件电喷雾离子源（ESI）；正负离子扫描；多反应监测（MRM）模式；离子化电压（IS）5 500、-4 500 V；离子源温度450 ℃；喷雾气（GS1，N2）压力50 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；辅助加热气（GS2，N2）压力55 psi；气帘气（N2）压力30 psi，其他参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.4 系统适用性考察精密吸取对照品、供试品溶液适量，在“2.2” “2.3” 项条件下进样测定，结果见图1～2。由此可知，虽然柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 离子对相同，但通过优化流动相梯度洗脱程序可使两者得到有效分离，并且其他成分对测定均无干扰。

图1 荆防颗粒总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of Jingfang Granules

图2 各成分提取离子流图Fig.2 Extracted ion current chromatograms of various constituents

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” “2.3” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，并分别以信噪比3 ∶1、10 ∶1 计算检测限、定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5.2 精密度试验精密量取“2.1.1” 项下对照品溶液100 μL，置于100 mL 量瓶中，20%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，分别精密吸取5 μL，在“2.2” “2.3” 项条件下进样测定6 次，测得胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二氢欧山芹醇当归酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸峰面积RSD 分别为1.19%、1.79%、1.62%、1.53%、1.68%、1.84%、1.76%、1.43%、1.52%、1.14%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验精密称取本品6 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在 “2.2”“2.3” 项条件下进样测定，测得胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二氢欧山芹醇当归酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸含量RSD 分别为1.03%、0.98%、1.15%、1.67%、1.83%、0.78%、0.82%、1.47%、1.60%、1.76%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验取供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、18、24 h 在“2.2” “2.3” 项条件下进样测定，测得胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二氢欧山芹醇当归酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸峰面积RSD 分别为1.32%、1.87%、1.06%、0.62%、1.11%、0.38%、1.51%、1.81%、0.69%、1.22%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的本品约5 g，精密加入对照品溶液（含胡薄荷酮2.52 μg／mL、升麻素苷153.1 μg／mL、5-O-甲基维斯阿米醇苷122.1 μg／mL、二氢欧山芹醇当归酸酯6.02 μg／mL、柴胡皂苷a 30.24 μg／mL、柴胡皂苷d 20.02 μg／mL、阿魏酸50.11 μg／mL、柚皮苷2 655 μg／mL、甘草苷100.2 μg／mL、甘草酸400.5 μg／mL）800、1 000、1 200 μL，每个水平3 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2”“2.3” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，胡薄荷酮、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、二氢欧山芹醇当归酸酯、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、阿魏酸、柚皮苷、甘草苷、甘草酸平均加样回收率分别为98.8%、98.4%、96.8%、98.5%、97.5%、97.6%、98.6%、98.6%、96.7%、98.7%，RSD 分别为0.9%、1.4%、1.2%、1.5%、1.5%、1.5%、1.9%、1.0%、1.3%、1.7%。

2.6 样品含量测定取4 批样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2” “2.3” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果（μg／g，n＝4）Tab.3 Results of content determination of various constituents （μg／g，n＝4）

3 讨论

本实验考察了提取溶剂乙腈、甲醇、50% 甲醇、10%甲醇，发现甲醇提取时提取率较高，但对部分成分色谱峰的峰形、峰强度有一定影响，而加入适量水稀释后两者均有明显改善，故确定提取方法为先用甲醇提取，再用20% 甲醇稀释定容。然后，考察了流动相乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1% 甲酸，发现后者洗脱时各成分色谱峰响应值较高，峰形较好，故选择其进行梯度洗脱。

含量测定结果表明，部分批次荆防颗粒中胡薄荷酮含量较低，并且不同厂家批次样品中其他成分含量也存在差异较大的情况，可能是投料或是样品制备工艺某些环节出现问题，需引起关注。