基于UHPLC-Q-Orbitrap／MS 的不同产地西洋参皂苷类成分分析

梁力文，郭 娜，刘小康，黄 鑫，蔡广知，郭云龙*，贡济宇*

（1.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117； 2.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117）

西洋参为五加科人参属植物西洋参Panax quinquefoliumL.的干燥根［1-2］，又名美国参、洋参、花旗参等，具有补气养阴、清热生津的功效［3-5］，其主要含有皂苷类成分，在抗肿瘤、抗炎、降血压、降血脂、抗肿瘤等方面发挥重要作用［6-11］。

西洋参原产于加拿大安大略、美国威斯康辛州，我国自上世纪80 年代引种西洋参［12-14］。目前已经形成吉林、辽宁、黑龙江、山东等主产区，由于气候、海拔、温度等其他因素的影响，来自不同产区的西洋参品质有差异，地理来源影响了西洋参中皂苷类成分的含量［15-18］。HPLC 法、FT-IR 法用于皂苷类成分鉴定［19-21］。然而，这些方法测定皂苷数量有限，液质联用可以实现高通量的数据采集，并实现全面的数据挖掘弥补了前者的不足，近年来已广泛应用于中药复杂系统的研究。

本研究基于UHPLC-Q-Orbitrap／MS 技术结合主成分分析、正交偏最小二乘法对吉林、山东、黑龙江、辽宁产西洋参中皂苷类成分进行分析，以期为不同产地西洋参的质量评价提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 Ultimate 3000 超高效液相色谱、QOrbitrap-MS／MS 仪 （美国Thermo Fisher Scientific公司）； AB135-S 型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ-500E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 人参皂苷Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd 及拟人参皂苷F11对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号B21052、B21055、B21057、B21050、B21058、B21053、B21051、B21054、B20902，纯度均大于98%）。乙腈、磷酸（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 甲醇（色谱纯，美国Tedia 公司）； 水为超纯水。西洋参来源于4 个不同产区，分别为吉林集安、山东威海、黑龙江绥化、辽宁新宾各10 批，共40 批样品，经长春中医药大学蔡广知副教授鉴定为五加科植物西洋参PanaxquinquefoliumL.的干燥根。

2 方法

2.1 供试品溶液制备 取西洋参粉末（过3 号筛）0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入5 mL 70%甲醇，密封，称定质量，超声提取45 min，放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rb3、Re、Rg1、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rd 及拟人参皂苷F11对照品适量，加70%甲醇定容至5 mL 量瓶中，即得。

2.3 色谱条件 Supelco C18色谱柱（3.0 mm×50 mm，2.7 μm）； 流动相乙腈 （A）-0.1% 甲酸水（B），梯度洗脱（0 ～2 min，15% A； 2 ～15 min，15% ～30% A； 15 ～25 min，30% ～95% A； 25 ～27 min，95% ～15%A； 27 ～35 min，15%A）； 体积流量0.5 mL／min； 柱温35 ℃； 进样量5 μL。

2.4 质谱条件 电喷雾电离源（ESI）； 负离子模式； 鞘气体积流量35 arb； 辅助气体积流量10 arb；毛细管电压-3.5 kV； 毛细管温度350 ℃； 扫描范围m／z150～2 000。

2.5 数据采集及分析 按“2.1” “2.2” 项下方法制备供试品、对照品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，得到总离子流图。通过Sieve 软件进行数据预处理，包括去噪、峰提取、峰对齐、峰识别和归一化等。将处理后的数据导入SIMCA 14.0 软件，进行无监督的主成分分析和有监督的正交偏最小二乘法判别分析，根据VIP ＞1 及P＜0.05寻找差异皂苷，并用GraphPad Prism 9 软件对不同产地的皂苷类成分的相对含量进行比较。

3 结果

3.1 不同产地西洋参皂苷类成分鉴定 共得到62个皂苷类化合物。图1 显示了不同产地西洋参在负离子模式下的基峰色谱图。所鉴定化合物的详细信息见表1。

表1 不同产地西洋参皂苷类成分Tab.1 Saponins of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

图1 不同产地西洋参在负离子模式下的基峰色谱图Fig.1 Basal peak chromatograms of Panacis Quinquefolii Radix from different origins in negative ion model

3.2 主成分分析（PCA）由图2 可知，QC 样本聚集保证实验的系统稳定性。4 组样本完全分离，每组样本较为集中的聚集为1 类，说明组内重复性较好，存在较好的区分度。辽宁、吉林、黑龙江样本最为接近，表明3 地西洋参所含成分最为相似，说明地理位置相近的产地采集的样本成分具有相似性。山东样本与其他产地样本相距均较远，表明山东样本化学成分与其他产地样本差异显著。

图2 不同产地西洋参PCA 得分图Fig.2 PCA score plot of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.3 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）共得到6 组结果。由图3 可知，每组2 个产地样本相距较远，分布在左右两侧，无任何重叠现象，差异明显。山东与吉林、山东与辽宁、山东与黑龙江、辽宁与黑龙江、辽宁与吉林、黑龙江与吉林的OPLS-DA 模型解释程度参数R2Y分别为0.999、0.995、0.994、0.998、0.999、0.999，预测能力参数Q2分别为0.988、0.981、0.981、0.911、0.88、0.956，数据表明模型解释度和预测度良好。

图3 不同产地西洋参OPLS-DA 得分图及S-plotFig.3 OPLS-DA sore plot and S-plot of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.4 差异成分分析 根据VIP＞1，P＜0.05 筛选并鉴定得到28 个不同产地西洋参差异皂苷类化合物，包括原人参二醇型13 个、原人参三醇型6 个、齐墩果烷型4 个、奥克梯隆型2 个、C-17 侧链变异型3 个。

3.4.1 原人参二醇型 共鉴定得到原人参二醇型皂苷13 个，见图4。4 个产地中丙二酰人参皂苷Rb1、丙二酰人参皂苷Rc、丙二酰人参皂苷Rd，人参皂苷Rb1含量均较高。吉林、黑龙江、辽宁的珠子参苷F5含量相近，且明显低于山东产地。5种差异成分在山东产西洋参中含量最高，分别为人参皂苷Rc，人参皂苷Rb3、西洋参皂苷Ⅰ、20（S）-人参皂苷Rg3、20 （R）-人参皂苷Rg3。西洋参皂苷Ⅲ在山东产西洋参中含量远低于其他产地，吉林产西洋参越南人参皂苷R4及丙二酰人参皂苷Rb2含量较高。综上所述，原人参二醇型皂苷在4 个产地中的含量由高到低依次为辽宁、吉林、黑龙江、山东。

3.4.2 原人参三醇型 原人参二醇型和原人参三醇型皆是西洋参主要皂苷类型，共鉴定得到原人参三醇型皂苷6 个，见图5。山东产西洋参人参皂苷Re 含量低于其他产地。山东产西洋参野三七皂苷E 含量远高于其他产地，可作为山东产地的标志性成分。吉林产西洋参三七皂苷R1含量最高。3 种差异成分在辽宁产西洋参中含量最高，分别为人参皂苷Rg1、丙二酰人参皂苷Re、20 （S）-人参皂苷Rg2。综上所述，原人参三醇型皂苷在4 个产地中的含量由高到低依次为辽宁、吉林、黑龙江、山东。

图5 不同产地西洋参原人参三醇型皂苷含量柱形图Fig.5 Histogram of protopanaxatriol-type saponin content of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

3.4.3 其他 4 个产地西洋参样品中鉴定出差异皂苷类化合物，齐墩果烷型4 个，分别为人参皂苷Ro、屏边三七皂苷R2、竹节人参皂苷Ⅳ、竹节人参皂苷Ⅱ； 奥克梯隆型2 个，分别为越南人参皂苷R1、24 （R）-拟人参皂苷F11； C-17 侧链变异型3个，分别为西洋参皂苷L11、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5，见图6。在4 个产地中，C-17 侧链变异型皂苷含量远低于其他类型皂苷，吉林和黑龙江产西洋参的齐墩果烷型皂苷含量相近且较高。在奥克梯隆型皂苷中，山东产西洋参越南人参皂苷R1含量最高，辽宁产西洋参24 （R）-拟人参皂苷F11含量最高。综上所述，山东、吉林、辽宁、黑龙江地区西洋参皂苷存在一定差异，地理位置，环境条件的不同可能是导致差异的主要原因。

图6 不同产地西洋参齐墩果烷型、奥克梯隆型、C-17 侧链变异型皂苷含量柱形图Fig.6 Histogram of oleanolane-type，oxytetracycline-type and C-17 side chain variant saponin content of Panacis Quinquefolii Radix from different origins

4 讨论

西洋参作为名贵中药材，近年来市场需求增大。目前，国内西洋参主产于东北及华东地区。西洋参种植由山东、吉林等传统产地大规模向新产区扩展，其盲目引种及扩大产区，致使药材的质量下降，因此，建立一种快速区分不同产地西洋参的方法对其质量控制具有重要意义。

本研究通过UHPLC-Q-Orbitrap／MS 技术，并结合统计学方法对不同产地西洋参进行分析，4 个不同产地西洋参有很好的分离度，表明不同产地可引起西洋参相关成分发生显著变化。为了消除组内差异的影响，采用OPLS-DA 对山东、吉林、黑龙江、辽宁产的西洋参两两组合分别进行分析，结果表明所分析的数据没有过度拟合。研究发现4 个产地样本之间主要代谢物人参皂苷类成分存在差异，各产地西洋参皂苷类成分种类相近但含量有所不同，辽宁产西洋参皂苷含量较为突出。OPLS-DA 筛选得到28 个差异化合物，包括原人参二醇型13 个、原人参三醇型6 个、齐墩果烷型4 个、奥克梯隆型2个、C-17 侧链变异型3 个，原人参二醇型和原人参三醇型皂苷在4 个产地相对含量由高到低依次为辽宁、吉林、黑龙江、山东。主要差异性成分的表征可为不同产地西洋参差异研究提供基础。本研究只收集了4 个产地的西洋参样品，但还未收集到市面上所有产地的西洋参样品，在西洋参产地后续的研究中，可以考虑尽可能的收集更多产地的西洋参。使覆盖面更广，以期早日建立涵盖所有西洋参产地的差异性皂苷数据库。

综上所述，本研究揭示了国内主要西洋参产地中皂苷成分的差异性，为西洋参不同产地鉴别、应用及质量评价提供理论依据。