化风丹药母发酵过程中优势菌种分离鉴定及不同温度和pH 值下菌株生长情况

曹国琼，刘 敏，刘 耀，徐 剑，陈有丽，吴静澜，张永萍*

（1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025； 2.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025，4.遵义廖元和堂药业有限公司，贵州 遵义 563000）

化风丹1951 年被列入国务院保护的四大名药之一，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，主要用于治疗中风偏瘫、癫痫等症［1-2］。化风丹药母制作技艺入选国家级非物质文化遗产，其将白附子、生半夏、生南星、生川乌、郁金、神曲粉碎成细粉，加入牛胆汁，自然条件下发酵。

发酵是中药炮制方法之一，借助微生物的作用，可以改变中药原有药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症［3-5］。发酵的过程实际上是生物转化的过程，微生物在生长代谢过程中产生的各种酶，能够产生多种反应，分解转化原料中特定的底物生成新的活性成分，同时产生丰富的次级代谢产物［6-7］。

化风丹药母制备采用传统自然发酵，受外界环境的影响较大，可控性低，使得药母质量及安全性不够稳定，对化风丹临床疗效和现代化生产不利［8］。随着中药现代化发展的需求，纯种发酵代替自然发酵，是质量控制的有效手段。目前发酵类药物如半夏曲、六神曲等均对发酵过程中的优势微生物进行筛选和鉴定［9-12］。但对化风丹药母研究主要集中在其发酵过程中化学成分含量变化和发酵条件优选［13-15］，在微生物发酵方面研究很少。本研究对化风丹药母发酵过程中不同时间点的微生物的菌群种类和数量变化进行初步研究，分离鉴定优势菌株，考察不同温度和pH 值对优势菌株生长的影响，以期为化风丹发酵的深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 FA1004 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）； HZQ-F160A 恒温培养振荡箱（上海一恒科学仪器有限公司）； YXQ-LS-100Sll 立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）； SW-CJ-2F 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）； TGL-16B 离心机（上海安亭科学仪器厂）； Tissuelyser-48 多样品组织研磨仪（上海净信事业发展有限公司）； HY-2 漩涡混匀仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）； ProFlexTMPCR 仪（美国Life Technologies 公司）； 电泳仪（美国Bio-Rad 公司）； MultisKan Sky 酶标仪 （美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 试剂与药物 川乌、天南星、半夏、白附子、郁金、神曲、牛胆汁购自亳州康美中药城，经贵州中医药大学肖承鸿高级实验师鉴定为正品。无水乙醇、可溶性淀粉、蔗糖、氯化钠均购自国药集团化学试剂有限公司； 胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxoid 公司； 马铃薯葡萄糖琼脂（不含抗生素）、琼脂粉、革兰氏染色试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司； Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒、细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒、Ezup 柱式酵母基因组DNA 抽提试剂盒、DNA 分子标准Marker、50X TAE Buffer、4S Green Plus 无毒核酸染料、琼脂糖、Taq PCR Mix 预混液（2X，含蓝染料）、PCR 引物均购自生工生物科技（上海）有限责任公司； 异丙醇购自天津市鑫铂特化工有限公司； 氢氧化钠、盐酸购自重庆川东化工（集团）有限公司； 磷酸氢二甲、硫酸镁、磷酸二氢钾均购自西陇科学股份有限公司； 尿素购自天津市风船化学试剂科技有限公司； 麦芽糖购自天津市致远化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 化风丹药母的制备 参考文献［8］报道，精密称取白附子28.20 g、生半夏28.20 g、生天南星28.20 g、生川乌28.20 g、郁金14.10 g、神曲0.14 g 混匀，加入牛胆汁126.70 g 搅拌均匀，置于密闭玻璃器皿中，放入恒温恒湿培养箱，在35 ℃、相对湿度60% 下发酵，发酵前取样1 次，之后每1 周取样1 次，共发酵6 周，样品于-20 ℃冰箱储存备用。

2.2 微生物的培养、菌落计数和纯化保存 取各发酵时间点样品0.5 g，在无菌条件下制备为细菌密度为1×10-1的菌悬液，依次稀释成1×10-2、1×10-3、1×10-4的菌悬液，根据不同发酵时间段样品菌落数选取合适的3 个稀释梯度。吸取合适稀释度的样品100 μL 注入固体培养基平皿，用涂布棒将其涂布均匀，重复3 次。细菌培养皿置于37 ℃培养箱培养1 d。霉菌和酵母菌培养皿置于25 ℃培养箱培养6 d，进行菌落计数。取单一菌落划线分离、培养，将菌落形态相似且出现频率多的微生物作为优势菌种进行分离纯化（尽可能多挑出形态不同的菌落），于4 ℃冰箱冷藏，并尽快对其进行菌种鉴定。

2.3 化风丹药母优势菌株鉴定

2.3.1 形态学鉴定 直接观察菌体在培养基中的菌落形态，用显微镜观察菌体内部结构。

2.3.2 分子生物学鉴定

2.3.2.1 优势细菌分子生物学鉴定 按照细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒提取细菌DNA，利用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），对药物中分离菌落的基因组DNA 进行PCR 扩增。使用酶为Taq PCR Master Mix，PCR 反应体系为模板DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 25 μL，补充ddH2O 至50 μL。反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 个循环； 72 ℃10 min。取2 μL 扩增产物在1%琼脂糖上进行凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶拍照系统检测扩增产物。扩增产物由生工生物科技（上海）有限责任公司测序。将测序结果复制于NCBI 网站上使用Blast 进行同源性比较，下载同源性较高的序列采用MEGA-X 软件的Neighbor-Joining 方法，1 000次Bootstrap 检验后构建系统发育树。

2.3.2.2 优势真菌分子生物学鉴定 采用Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒、Ezup 柱式酵母基因组DNA 抽提试剂盒提取霉菌及酵母菌的基因组DNA。利用霉菌通用引物ITS1 （5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′），酵母菌通用引物NL-1 （5′-GCATATCAATAAGCG-GAGGAAAAG-3′）和NL-4（5′-GGTCCGT-GTTTCAAGACGG-3′）对药物中分离菌落的基因组DNA 进行PCR 扩增。使用酶为Taq PCR Master Mix，PCR 反应体系为DNA 1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 25 μL，补充ddH2O 至50 μL。反应程序为94 ℃5 min； 94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 个循环； 72 ℃5 min。其他同“2.3.2.1”。

2.4 温度对优势菌株生长的影响 参考文献［7］报道，将处于对数生长期的阿氏芽孢杆菌按5%的接种量接入于200 mL LB 液体培养基内，分别于20、25、30、35、40 ℃在150 r／min 下培养40 h，在600 nm 波长处测定光密度（OD）值，每4 h 1次； 接种汉逊德巴利酵母菌于YEPD 基础培养基中，置于上述温度条件下培养，在660 nm 波长处测定OD 值，重复3 次。以生长时间为横坐标（X），OD 值为纵坐标（Y）进行回归。以马铃薯葡萄糖琼脂为介质制成直径为8 mm 米曲霉菌饼，接种于pH 值7.0 的固体培养基中央，置于上述温度条件下培养192 h，用十字交叉法测菌落直径，以生长时间为横坐标（X），直径为纵坐标（Y）进行回归。

2.5 pH 值对优势菌株生长的影响 参考文献［8］报道，用盐酸和氢氧化钠将LB 液体培养基、YEPD 基础培养基、PDA 培养基pH 值分别调至5、6、7、8、9。将处于对数生长期的阿氏芽孢杆菌按5%的接种量接入于200 mL LB 液体培养基内，置于恒温培养振荡箱培养40 h，在600 nm 波长处测定OD 值，每4 h 1 次； 接种汉逊德巴利酵母菌于不同pH 值的YEPD 基础培养基中，于恒温培养振荡箱150 r／min 下培养40 h，在660 nm 波长处测定OD 值，每4 h 1 次，重复3 次，以生长时间为横坐标（X），OD 值为纵坐标（Y）进行回归。以马铃薯葡萄糖琼脂为介质制成直径为8 mm 米曲霉菌饼，分别接种于不同pH 值的固体培养基中，最适温度下培养192 h，用十字交叉法测菌落直径，以生长时间为横坐标（X），直径为纵坐标（Y）进行回归。

3 结果

3.1 菌落数 由表1 可知，化风丹药母整个发酵炮制过程中细菌数量先增加后减少，发酵0 周至3周呈缓慢增长趋势，菌落数处于1.50×102～6.60×102cfu／mL； 发酵至第4 周，数量急剧增加，第5周和第6 周细菌数量趋于稳定，约为1.40×103cfu／mL。酵母菌在发酵0 周至3 周时，数量急剧增加，从1.32×103cfu／mL 快速增长至1.85×104cfu／mL； 发酵第4 周的酵母菌数量呈现减少趋势，到第6 周仅有1.00×102cfu／mL。霉菌在0 周时没有生长，1 周至4 周数量平稳增加，之后5 周和6 周数量又呈现减少趋势。

3.2 菌落形态及显微观察 7 个不同发酵时间点样品共挑选出41 株优势菌，其中细菌12 株，酵母22 菌株，霉菌7 株。对优势细菌进行形态学观察及革兰氏染色，其形态呈圆形、椭圆形、不规则形等，大部分显微观察为直杆状，且为革兰氏阳性菌； 对优势酵母菌进行形态学观察，其形态呈圆形、类圆形、椭圆形等，可观察到明显的出芽，具有细胞壁、细胞膜，含有液泡； 对优势霉菌外观进行形态学观察，其形态孢子及菌丝颜色，同样可观察到菌丝和孢子。

从不同发酵炮制时间的样品中分离出了细菌、霉菌、酵母菌，将挑选的优势菌种进行汇总，其中，细菌出现次数最多的为X1； 酵母菌由于性状大小均相似，无法从外观性状观察是否一样，必须通过物种鉴定才能得出； 霉菌出现次数最多为M4、M8。

3.3 优势菌种的分子生物学鉴定及筛选 采用16S rDNA、26S rDNA 序列分析、相似性比对及构建系统发育树分别对优势细菌、真菌进行鉴定。X1、X11 ～ X12 为阿氏芽孢杆菌 （Bacillus aryabhattai），X2 为沙福芽孢杆菌 （Bacillus safensis），X3 为漳洲芽孢杆菌 （Bacillus zhangzhouensis），X4 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），X5、X8 为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis），X6 ～ X7、X9 为Paraclostridiumbifermentans，X10 为Paraclostridium benzoelyticum。J1、J3 ～J22 为汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii），J2 为白色念珠菌（Candidaalbicans），由于该菌细胞呈卵圆形，很像酵母菌，导致与酵母菌一起分离纯化鉴定，其数量很少。M1 为烟曲霉（Aspergillusfumigatus），M2 为伞状毛霉菌（Lichtheimiacorymbifera），M4、M8 为米曲霉 （Aspergillusoryzae），M7 为聚多曲霉（Aspergillussydowii），M5、M9 为皱瓣曲霉（Aspergillusrugulosus）。结合菌落计数与分子生物学鉴定结果，即挑选各样品培养皿中出现频率多的微生物作为研究对象，最终确定细菌优势菌种为阿氏芽孢杆菌，酵母菌优势菌种为汉逊德巴氏酵母菌，霉菌优势菌种为米曲霉。图1 ～3 分别为优势细菌、酵母菌、霉菌的系统发育树。

图1 优势细菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of dominant bacteria

图2 优势酵母菌的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of dominant yeasts

图3 优势霉菌的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of dominant molds

3.4 不同温度下优势菌株生长情况 由图4 可知，在35 ℃时，阿氏芽孢杆菌无论是菌体生长速率还是菌体最大产量均较高，表明阿氏芽孢杆菌的最适温度为35 ℃； 在25 ～30 ℃时，汉逊德巴利酵母菌无论是菌体生长速率还是菌体最大产量均较高，且在32 h 时生长趋于平稳，表明汉逊德巴利酵母菌最适生长于25 ～30 ℃下且32 h 即能达到生长对数周期； 在35 ℃时，米曲霉从生长第1 天至第5 天保持快速增长，于第5 天后便停止生长，保持平稳状态； 20 ～30 ℃依然每天匀速增长，均至第8 天后停止生长； 在40 ℃时，米曲霉的生长明显处于抑制状态； 表明米曲霉最适生长温度为35 ℃。

3.5 不同pH 值对优势菌株生长的影响 由图5可知，在pH 值为5～9 的LB 液体培养基下培养的阿氏芽孢杆菌均能得到较好生长，在pH 值为8时，阿氏芽孢杆菌无论是菌体生长速率还是菌体最大产量均较高，并于24 h 后生长趋势不变，表明阿氏芽孢杆菌最适生长pH 值为8； 在pH 值为6时，汉逊德巴利酵母菌在0～12 h 生长趋势不明显，于16 h 快速生长，并于32 h 停止生长，其生长速度最快且产量最大，表明汉逊德巴利酵母菌最适生长pH 值为6； 在pH 值为7 时，米曲霉的直径在第6 天达最大，且生长速度较其他pH 条件下的速度要更快，表明米曲霉最适pH 值为7。

4 讨论

化风丹是贵州省传统名药，能息风镇痉、豁痰开窍，临床治疗中风效果显著。药母是化风丹的君药，需要在自然条件下发酵后方可入药。化风丹药母发酵过程中存在细菌、霉菌、酵母，发酵是三者共同作用的结果。研究化风丹药母发酵过程中的微生物，可以为进一步揭示化风丹药母发酵机制及药母发酵工艺和质量控制提供参考。

本研究通过菌落计数的方法筛选优势菌株，鉴定优势细菌为阿氏芽孢杆菌，优势酵母菌为汉逊德巴利酵母菌，优势霉菌为米曲霉。文献报道研究，阿氏芽孢杆菌具有很强耐受性［16］、抗逆性［17］，对人体安全，可以分泌左旋天冬氨酰酶。汉逊德巴利酵母菌是一种重要的非传染性酵母，在自然环境下生存能力强，在发酵过程中能产生香气物质以改善产品风味、生产燃料酒精所必需的嗜热β-葡萄糖苷酶［18］，并能产生一种杀伤毒素抑制白色念珠菌和热带念珠菌的生长［19］。米曲霉是一种能产蛋白酶的菌株，可以提高发酵物质的全氮利用率和蛋白质利用率，从而改善最终产品的质量［20］。

经发酵炮制后，中药品质的高低不仅与发酵的菌种有关，还与发酵条件如温度、相对湿度、pH值等都有密切关系［21］。化风丹药母的炮制是微生物发酵的过程，微生物的发酵依赖其中优势菌株的性能，发酵条件和发酵工艺对优势菌株的生长有影响。温度是调控微生物生长繁殖最重要的因素之一，酶促反应与温度有密切关系，温度升高，细胞繁殖加快，酶失活的速度也加快，发酵周期缩短，这可能是为何在不同季节发酵炮制的周期和药材成分有差异的原因。通过本研究明确了3 种菌的最适宜生长温度、pH 值，为后续进一步研究奠定了基础。