HPLC 法同时测定大籽蒿和细叶亚菊中5 种成分

谢雨宸，彭 芳，王 悦，易 欢，徐鑫梅，范 刚

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137）

大籽蒿为常用藏药材，在《晶珠本草》 《晶镜本草》 等藏医药经典著作中均有记载，为五味甘露药浴汤散、二味小檗汤散等藏药复方的组成药味［1-2］。大籽蒿具有清热、解毒、止血、消肿、利肾等功效，可用于治疗四肢关节肿胀、肺病、肾病、咯血、气管炎、风湿痹痛等［3］。现代药理研究表明，大籽蒿提取物具有抗炎、抗癌、抗菌、降血糖［4-5］等活性。课题组前期调查发现，部分地区藏医院或药材市场以细叶亚菊Ajaniatenuifolia（Jacquem.ex DC.）Tzvelev in Schischk.＆ Bobrov 替代大籽蒿ArtemisiasieversianaEhrhart ex Willd.使用。然而，2 种药材在临床上能否替代使用仍然缺乏足够的科学依据。

目前，对于大籽蒿和细叶亚菊的化学成分定性和定量研究较少［6-7］，然而2 种药材之间的主要化学成分是否有差异目前没有研究报道。HPLC 法具有分析速度快、灵敏度高、适用范围广等特点，在藏药质量控制及评价中发挥着重要的作用［8-11］。本研究采用HPLC 法首次建立大籽蒿和细叶亚菊中绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 的含量测定方法，并比较两者的差异，以期为大籽蒿的质量控制，以及细叶亚菊是否能替代大籽蒿入药提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； Sartorius BP121s 电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］； SB-4200DTD 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ULUP-I-10T 优普超纯水机（成都超纯科技有限公司）。

1.2 试剂与药物 绿原酸（批号DSTDL002102）、伞形花内酯（批号DSTDQ006602）、异绿原酸A（批号 DSTDY054701）、异绿原酸 C （ 批号DSTDY003804）对照品购自成都德思特生物技术有限公司； 芦丁（批号MUST-17111601）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司，所有对照品纯度均大于98%。甲醇、乙腈为色谱纯； 其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

本研究共收集10 批大籽蒿和14 批细叶亚菊药材，由成都中医药大学民族医药学院范刚教授鉴定分别为菊科蒿属植物大籽蒿Artemisiasieversiana和亚菊属植物细叶亚菊Ajaniatenuifolia的干燥地上部分。详细信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 对照品适量，置于5 mL 量瓶中，加入甲醇制成质量浓度为0.898、0.526、0.894、3.402、0.584 mg／mL 的贮备液。精密量取上述贮备液各3 mL 置于25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含绿原酸0.108 mg、伞形花内酯0.063 mg、芦丁0.107 mg、异绿原酸A 0.408 mg、异绿原酸C 0.070 mg 的对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备 取药材粉末（过3 号筛）约0.2 g，精密称定，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率480 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再次称定质量，用50% 甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 CAPCELL PAK-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），梯度洗脱（0 ～15 min，8% ～10% A；15～16 min，10% ～11%A； 16～20 min，11% ～14%A； 20～30 min，14% ～15%A； 30 ～40 min，15% ～17%A； 40 ～55 min，17% ～20% A； 55 ～65 min，20%A）； 体积流量1 mL／min； 柱温30 ℃； 检测波长290 nm； 进样量10 μL。

2.4 专属性试验 取对照品，大籽蒿、细叶亚菊供试品适量，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分在同一保留时间上有相应色谱峰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得到系列浓度的对照品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationship of various constituents

2.6 精密度试验 取同一份大籽蒿（批号DZH-4），按 “2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为0.10%、0.43%、0.17%、0.14%、0.71%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液（批号DZH-4），于0、1、2、4、8、12、24 h 在“2.3” 项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 峰面积RSD 分别为 0.13%、0.82%、0.27%、0.50%、1.75%表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验 取大籽蒿（批号DZH-4）6 份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，测得绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 含量RSD 分别为0.84%、1.18%、1.65%、1.21%、1.89%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取各成分含量已知的大籽蒿粉末（批号DZH-4）6 份，每份0.1 g，精密称定，精密加入各对照品适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery test of various constituents （n＝6）

2.10 样品含量测定 取各批样品粉末适量，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（mg／g，n＝2）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg／g，n＝2）

2.11 大籽蒿与细叶亚菊5 种化学成分的比较分析 将表4 的数据导入GraphPad Prism 5.0 软件进行t检验，结果见图2，可知2 种药材中各成分含量均无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备及色谱条件考察 本研究考察了超声、冷浸、水浴回流提取方法，考察了乙醇、甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇等溶剂的提取效率，并对提取时间（20、30、40 min）及溶剂用量（20、50、100 mL）进行考察，最终发现以50 mL 50%甲醇超声提取30 min 的效果最佳。此外，对流动相、色谱柱、检测波长等进行了考察，根据5 种化学成分的分离度、对称因子等确定了最佳的HPLC 色谱条件。

3.2 各成分含量测定结果分析 本研究首次建立了大籽蒿中5 种化学成分的HPLC 含量测定方法。结果表明，大籽蒿中绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C 的平均含量分别为3.61、0.71、1.46、8.74、1.44 mg／g，细叶亚菊中绿原酸、伞形花内酯、芦丁、异绿原酸A、异绿原酸C的平均含量分别为2.60、0.26、0.79、6.31、1.22 mg／g，两者皆以异绿原酸A 含量最高，绿原酸含量次之，而伞形花内酯的含量最低。现代药理研究表明，异绿原酸A 和异绿原酸C 具有抗炎、祛痰等作用［12］，绿原酸具有抗氧化、抗菌、保护心血管等作用［13-14］，芦丁具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用［15］，伞形花内酯具有抗炎、抗氧化、免疫调节［16-18］等作用。这5 种成分的药理活性与大籽蒿的功能主治密切相关，可能为其主要的活性成分，因此建立这5 种成分的含量测定方法对大籽蒿药材的质量控制与评价具有重要的意义。

3.3 大籽蒿与细叶亚菊化学成分的比较分析 由于“同名异物” 和“同物异名” 现象、资源限制、不同地区用药习惯差异等因素，藏药在市场流通和临床应用过程中常出现地区习用品或替代品［19］。课题组前期调查发现，部分藏医院或药材市场以细叶亚菊替代大籽蒿使用。然而，目前对于两者在临床上是否能等同使用仍然缺乏科学依据。本研究结果显示，大籽蒿与细叶亚菊中5 种成分均无显著性差异（P＞0.05），表明两者具有相似的化学成分，这说明部分藏区用细叶亚菊替代大籽蒿入药有一定的科学性。然而，本研究只比较了5 种主要化学成分，2 种药材中其他成分是否有差异还需进一步的研究。今后需加强化学成分分离及定性定量分析研究工作。此外，也应采用药理学研究方法评价2 种药材的生物活性是否具有差异。通过化学成分和生物活性的比较，可多维评价2 种药材的质量差异，为其临床合理用药提供参考依据。