兽用中药生物学检测方法与评价技术

龚旭昊,李慧杰,董玲玲,顾进华*

(1.中国兽医药品监察所,北京 100081;2.农业农村部中兽医生物学重点实验室,北京 100081)

兽用中药是在中兽医药理论指导下使用的药物及其制剂,具有多成分、多靶点,整体调节等特点。近年来,随着我国养殖业的发展,兽用中药因具有绿色天然、毒副作用低、整体功效强、不易产生耐药性等优点,越来越得到人们的重视和认可[1]。

中药质量是保障药品安全有效、稳定可控的基础。中药的质量控制问题一直是制约我国兽用中药现代化发展的热点与难点问题。我国现行的兽用中药质量评价体系主要以西方国家对化学药品的理化检测控制方法为借鉴。然而,化学药品成分单一、疗效与机制明确,对于成分复杂、药效物质基础研究相对薄弱的兽用中药,该体系并不完全适用,探索符合兽用中药自身特点的质量控制体系就尤为重要。

随着技术的发展,生物学检测与评价技术逐步应用于中药质量控制研究之中,可以较好地弥补现行质控方法的不足,有利于提高兽用中药质量的可控性。生物学检测方法主要包括动植物显微鉴别、DNA分子鉴定、生物效价测定,以及正在不断发展的基因组学和代谢组学等技术。由于生物学评价技术具有药效相关、整体可控等优势,是符合中医药特点的质量标准控制模式及方法,亦是中药质量标准化的重要发展方向[2]。以下就生物学检测方法与评价技术在兽用中药质量控制中的应用价值进行阐述,以期为提升兽用中药质量控制水平,保证临床用药的有效性和安全性提供更多选择。

1 显微鉴别与兽用中药真伪鉴定

1.1 显微鉴别技术 1838年德国学者Schleiden阐明了细胞是植物体的基本单位,并利用显微镜观察了多种生药的显微构造,发现根据显微构造的不同,各种生药可以准确区别[3]。自此,利用显微镜鉴别生药的方法得到了逐步的发展。我国中药的显微鉴别研究虽然起步较晚,但经过半个多世纪的系统性研究,现今显微鉴别已成为我国中药及制剂鉴别的重要方法之一,因具有快速、简便、准确的特点而得到广泛的应用。

中药来源于植物、动物和矿物,其微观结构因种类的不同而有显著差异,这些微观结构的差异可以作为显微鉴别的依据。兽用中药相比人药,其制剂品种多为散剂,在《中国兽药典》2020年版二部中,有近80%的成方制剂有显微鉴别项。应用显微鉴别技术,不但可检测出成方制剂所列出的组分,还能够通过专属性鉴别特征检测出处方中某些未列出的组分,包括真伪、优劣、掺杂、改变处方等情况,从而弥补了理化鉴别的不足,对兽用中药的质量控制具有重要作用。

1.2 显微数码成像技术 兽用中药大多来源于植物,显微鉴别的要点是鉴别其组织、细胞或内含物等特征。在进行显微鉴别操作时,传统的操作只能一边通过目镜观察特征,一边进行手绘图像,这种方法难免使研究结果有人为的主观误差,且工作效率较低[4]。显微镜数码成像技术是将光学显微镜技术、数码摄影成像技术、光电转换技术及液晶屏幕技术完美结合的一项显微成像技术,其通过显微数码成像系统,可以直接在电脑上更为清晰、实时的观察中药显微特征图像,还能将观测的图像在电脑上以图片的形式保存下来,大大的方便了使用者将图像数据保存的要求,也更加方便了资料数据的管理和编辑。此外,其能通过专业的配套软件对图像进行调整,标注,拼接,合成,测量、录像等,形成所需的图文文件,且可以互相传阅,实现多人同时观察,显著提高了工作效率。目前,显微数码成像技术在兽用中药显微鉴别工作中最为常用。

1.3 激光共聚焦显微技术 激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)是20世纪80年代发展起来的高技术光电仪器,是对普通显微镜质的飞跃,更是对电子显微镜的补充。其工作原理主要是通过在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激光荧光探针,利用计算机进行图像处理,从而可得到样品内部细微结构的荧光图像[5]。该技术具有高分辨率、高灵敏度和空间结构灵活性观察的独特优势,不仅可观察固定的细胞和组织结构,还可提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段,达到对细胞内的物质和信号进行定量分析的目的,现已广泛应用于现代生物学研究的各个领域,在中药研究中也发挥着日趋重要的作用。

首先,激光共聚焦显微技术基于对药材细胞无损、三维重建点扫描成像技术及强大的软件处理程序实现对药材细胞结构、细胞骨架、细胞器结构和分布及变化的动态追踪。通过共振荧光分子作用推定分子之间的距离,为中药材鉴别及道地药材质量评价提供了良好的思路与方法。如刘向东[6]利用激光扫描共聚焦显微镜研究植物细胞发育的形态学,结果细胞发育的形态学变化过程能被清楚地观察到。

2 DNA条形码分子鉴定法与兽用中药基原鉴定

2.1 DNA条形码分子鉴定法 DNA条形码分子鉴定法(DNA barcoding)是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是对传统形态鉴别方法的有效补充[7]。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种,具有准确、稳定和可靠的特点,该方法在物种鉴定方面具有广阔的应用前景[8]。

中药材DNA条形码分子鉴定通常是以核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系,其中植物类中药材选用ITS2/ITS为主体序列,以叶绿体psbA-trnH为辅助序列,动物类中药材釆用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)为主体序列,ITS2为辅助序列[9]。中药材DNA条形码分子鉴定技术被誉为中药鉴定学的“文艺复兴”,可将中药基原鉴定至物种水平。经过大量实践证实,该技术能有效实现对中药种子种苗、基原物种、药材、饮片及中成药等的基原鉴定[10]。“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”自2014年首次被收载于《中国药典》(2010年版第三增补本)至今已有9年,也使其逐渐成为药检机构的检测项目[11],越来越多的中药生产加工企业亦开始采用该技术来监控其原料药基原。随着该技术的不断推广,不仅有利于规范药材市场,而且促进了中药质量控制水平的提高,在中药全产业链各关键环节均发挥着重要作用。

2.2 DNA测序技术 DNA测序技术系指分析DNA碱基构成和碱基顺序的技术,一般采用双脱氧链终止法进行DNA测序。其原理是利用2′,3′-双脱氧核苷三磷酸(2′,3′-ddNTP)作为链终止试剂,通过DNA聚合酶催化和引物延伸产生一系列长度相差一个碱基的寡核苷酸,进行电泳分离,通过放射自显影或荧光确定DNA的序列。除双脱氧链终止法外,DNA测序技术还包括边合成边测序、单分子实时测序、纳米孔测序等技术。DNA测序分析可分为手工测序和自动测序,当前以自动测序为主流[12]。通过高精度的DNA序列分析手段测定中药材、中药饮片等所需被测的基因片段,并加以对比分析,进而实现鉴别的目的。选择用于DNA测序的基因片段需在种内高度保守,而在种间序列的差异较大,进而适用于中药材种间的鉴定[13]。

2.3 兽用中药标准核酸序列的建立 标准核酸序列系指供药品标准中要求的种属源性鉴别或鉴定的核酸序列,其具有确定的碱基排列顺序,是实施核酸检测的基础,用于药品检验、药品质量控制中涉及的动物、植物、微生物以及重组生物制品的种属鉴别或鉴定。药品标准中采用核酸序列进行鉴定的品种,都建有标准核酸序列[14]。标准核酸序列库的可靠性是DNA条形码分子鉴定的基础。目前已有的数据库,如GenBank,中药材DNA条形码鉴定系统,EMBL等,数据之间缺乏验证,由各位科研人员单独提供,质量参差不齐,为保证DNA条形码分子鉴定的可靠性,标准核酸序列应具备权威性、准确性、专属性和溯源性的标准。

据统计,兽医临床及畜牧养殖中常用的兽医专用中药有60余种[1],缺乏DNA分子鉴定研究基础,为了不与人药争资源,保障兽用中药原料质量,开展兽医专用中药DNA分子鉴定研究对促进兽用中药行业高质量发展具有重要意义。建立兽医专用中药DNA条形码标准要满足以下条件,首先应确保药材基原的准确性,然后应采用标准的序列校准程序。

2.3.1 确保药材基原准确 了解兽用中药材的产地和分布区域,样品应采自道地产区和主要分布区,所有采集的样品均应经过鉴定专家进行鉴定以确保药材基原准确。样品经专家鉴定后应进行规范化管理,根据样品编码规则对采集样品进行标准编码,并进行专门存放。

2.3.2 确保DNA条形码序列可靠性 对拼接好的中药DNA条形码序列进行质量评估时,主要以碱基的Q值(quality value)为依据,Q值代表了碱基测序的质量值,计算公式为Q=-10×lgP,P为每个碱基出错的概率。例如,若每100个碱基有1个错误,那么P=0.01,Q就为20,即Q20表示碱基错误率为1%。一般情况下,单向测序的碱基质量需要大于Q20(99%的可靠性),经双向测序拼接后的碱基质量需要大于Q30(99.9%的可靠性)[15]。序列质量判断标准采用国际DNA条形码协会(CBOL)通用的标准[16]。

2.3.3 保证序列和基原样品的一致性 除采集样品和实验过程规范操作外,需采用严格校对机制,即通过BLAST分析防错等措施,确保实验获得的序列和基原样品的一致性,避免在实验过程中由于操作不当引入的真菌污染和样品交叉污染。

所建立的兽用中药标准核酸序列信息应具有完整性,包括物种名称、编号、用途、样本来源、碱基序列和基于现有实物鉴定标准的相关描述。标准核酸序列建立后,应提交至国家有关管理部门审核,经批准后方可纳入标准核酸序列数据库使用。此外,标准核酸序列的建立单位应建立常规的质量保障体系,对其发行的标准核酸序列进行定期监测,确保标准核酸序列的及时更新。

3 基于基因芯片的兽用中药评价技术与方法

3.1 基因芯片的优势 基因芯片(Gene chip) 又称DNA微阵列,是生物芯片的一种,由美国Fodors等[17]在20世纪90年代初提出并研究,是专门用于核酸检测的生物芯片。其原理是将大量的分子探针附着固定于载体支持物上,与待测样品基因组DNA序列杂交进行核酸序列测定,借由荧光或电流等方式检测每个探针分子的杂交信号强度,进而获取样品分子的数量和序列信息。由于基因芯片技术能够一次性将大量探针固定在支持物上,因此可以同时对待测样品进行序列检测及分析,从而简化了传统核酸印迹杂交技术操作繁琐、效率低下等不足,同时减少了所需检测序列的数量,自动化程度显著提高[18]。

基因芯片技术以高通量、多因素、微型化和快速灵敏的特点而见长,在应用时可根据实际情况具体设计探针系列,选择具有针对性的分析检测方法,可极大地扩展此技术的应用范围,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等[19]。经过近30年的发展,基因芯片作为高度集成化的分析和研究手段已成为进行药物基因组学研究的主要平台。

3.2 基因芯片与兽用中药评价 早在三千多年以前,中药就被应用于促进动物生长及疾病防治。虽然兽用中药应用历史悠久,但缺乏高质量的科学证据来证明其有效性。由于采用以理化分析为主的研究方法常存在较多的局限性,导致人们长期以来对兽用中药的认识层次与研究手段基本保持在低效率与低通量。根据网络药理学理论,所有药物都是通过直接或间接修饰或改变人体基因及基因产物产生作用[20]。因此,利用基因芯片技术分析药物活性成分影响基因表达多态性变化就成为从分子水平上深入研究中药活性成分作用机制、有效成分筛选、质量控制及安全性评价等研究难题的重要方法。基因芯片技术是中药研究领域中一次具有深远意义的改革,具有极广的发展扩张性与应用深度,为中药现代化的发展提供了新途径。

3.2.1 基因芯片与中药质量控制 确保兽用中药的质量,是保证中兽医临床用药安全有效的前提。鉴于中药复方成分复杂,应用常规方法很难准确地鉴别其药用组分,可将基因芯片与从正品中药中得到的DNA杂交,得到标准基因图谱,与待鉴定中药的基因图谱比较分析即可达到鉴定的目的。

基因芯片在21世纪初即被应用于中药鉴定[21],发展至今,基因芯片在破碎药材、近缘相似种、炮制药材及贵重药材等的鉴别鉴定中均发挥了不可替代的作用。但值得注意的是,中药的药效成分大多是其次生代谢产物,基因芯片只能鉴别中药的真伪而不能对其优劣进行鉴定,不能取代中药化学成分指纹图谱等的鉴定[22]。

3.2.2 基因芯片与中药安全性评价 中药的安全性评价是中药现代化发展中的热点问题。中药进入国际市场通常需要提供安全性研究报告,因此,中药毒性的快速评价与筛选是中药研究领域亟待解决的问题[23]。对于兽用中药,除人畜共用中药外,兽医专用中药在临床及养殖中使用广泛,该类药材因毒性较大、安全性风险较高致人医很少使用。为保障养殖安全,开展兽用中药安全性评价极为重要。

传统的药理毒理研究方法很难对兽用中药的安全性进行较为全面的评价,而且对于慢性毒性和不良反应,传统研究方法需要消耗大量的人力、物力和时间,而且某些毒性和不良反应可能检测不到[24]。利用基因芯片技术将中药的毒副作用与基因表达特征联系起来,通过快速分析中药微量活性成分,高通量研究全组分作用靶点,依据基因的表达分析即可确定药物的毒性[25-26],从而提高兽用中药的安全性评价水平。

4 生物检测与兽用中药药效质量评价

当前中药质量控制与药效评价主要采用常规的理化及药理学方法,由于中药化学组成复杂,作用靶点多,活性、毒性成分及作用机制等研究尚不明确,常规方法虽然简单易行,但在有效性和安全性的控制上可能存在不足,较难保证中药的质量可控性[27]。美国食品药品管理局(FDA)将生物评价作为植物药质量控制的重要方法,2016年美国FDA正式发布的《植物药研发行业指南》(Botanical Drug Development Guidance for Industry)中要求,在仅采用化学检验不足以确保质量和疗效一致性的情况下,申请人应在植物药原料药和(或)药品放行质量标准和稳定性试验方案中纳入生物学检测方法。

生物学检测系指采用生物学方法,以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。生物学测定方法可广泛用于各种检测目的,包括鉴别、生物活性和杂质检测等,其中最主要的是生物活性(或效价、效力)测定。根据中药特点,研究探索生物学方法用于中药质量控制,与现行质控方法相互补充,为建立符合中医药特点的中药质量控制体系提供了新的路径,亦为保证临床用药的安全有效、质量可控提供更充分的科学依据。

4.1 中药生物活性测定 生物活性测定法,是以药物的生物效应为基础,以生物统计为工具,运用特定的实验设计,测定药物有效性的一种方法,从而达到控制药品质量的作用。该方法将复杂的中药活性成分作为“黑箱”,直接以药效为切入点评价中药质量,可为现有的质量标准扩充与完善提供有力借鉴,逐渐得到大家的重视与认可[28]。《中国药典》从2010-2020年版均收载了《中药生物活性测定指导原则》,明确了生物活性评价方法作为中药质量控制的具体原则,侧重于在中药质量标准领域中的应用。该方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。在应用时应优先选用生物效价测定法,对于不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法。

生物活性测定法操作简便,实验周期短,所测数据可直观反映药物功效,摆脱了“化学成分作为质控指标”的桎梏,有望在不断实践的同时得到蓬勃发展。然而由于生物活性测定法用于中药质量评价起步较晚,在实施、衍化与发展过程中仍存在不少障碍,如找寻与待测样品活性相似的对照品有一定难度,缺乏生物测定用的中药对照品[29];对于多种适应症的中药,其相关病症生物活性选择范围宽泛等。但对于功能主治明确、有效成分模糊、检测方法不够完善的中药,生物活性检测法能为其质量控制起到有效补充。

4.2 中药生物效应检测 生物效应检测是指利用药物对试验系所产生的生物效应,运用特定的实验设计,反映药物有效性、安全性的一种方法,从而达到评价和控制药品质量的目的。当前中药质量控制方法较难与临床有效性、安全性相关联,为制定并完善符合中药特点的中药质量控制体系,国家药品监督管理局药品审评中心于2020年12月17日发布了《中药生物效应检测研究技术指导原则(试行)》[30]。

中药生物效应检测方法是通过与中药有效性、安全性相关联,反映一类或多类活性/毒性成份的生物效应,是一种符合中药多成份、整体作用特点的质量控制方法,可较好地弥补现行质量控制方法的不足,适用于中药全生命周期的相关评价。目前,中药生物效应检测的相关评价方法可包括生物效价/生物毒价、生物活性限值、效应成份指数、生物标志物、生物效应表达谱等。基于中药有效性、安全性和质量可控性等因素,建议在以下三种情形中优先考虑该方法:①药理作用清楚、活性明显、量效关系明确,但有效成份不清楚的;②涉及毒性药味和(或)现代研究表明对人体具有较强的毒性反应,但产生毒性反应的成份尚不明确的;③检测的化学成份与临床疗效和安全性关联性不强的。

中药生物效应检测方法作为一种新技术和新方法,不同于一般的药理学实验方法,需要具备药理学与药检分析的双重属性和要求[2],其目前属于前瞻性、探索性的研究方法,因此在方法的广泛应用方面可能还存在一定困难,对方法的建立、技术难点和注意的问题还有待细化。

4.3 兽用中药的生物活性测定 如何更有效的控制和评价产品质量及临床疗效是目前兽用中药发展的焦点问题。中药的生物活性测定相对于理化测定在兽用中药药效评价方面的临床意义更大。早在上世纪90年代,兽药行业就认识到有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性测定来控制兽用中药质量。1992年,农业部批准的新药“黄芪多糖注射液”采用生物活性限值测定法,用测定小鼠脾增重关联中药制剂提高动物机体免疫力的能力,有效的控制了产品疗效。

随技术的发展及普及,生物活性测定在医药领域的中药质量控制实践中也逐渐被采用,如2005年版《中国药典》中水蛭的含量测定,消栓肠溶胶囊国家药品标准WS3-571(Z-67)-2005(Z)的效价测定,均为借鉴生物制品中酶效价测定方法。目前,中医药证候类生物活性检测方法一直是研究难点,张莉华等[31]基于活血化瘀药物多数具有的抗血小板聚集的作用机制,以中药活性成分丹酚酸B作为标准物质,建立了家兔体外抗血小板聚集生物效价检测方法,经第三方实验室验证重现性良好。上述成果为中兽药药效和安全性评价技术研究提供了借鉴与参考。

5 展 望

中国药典已经对清热解毒类、活血化瘀类中药制定了一些生物评价标准,以及动物药如蕲蛇的模板DNA提取、PCR反应等等。为全面地提升兽用中药材、饮片、提取物和制剂质量控制技术,建议加强生物学检测技术研究,推动基因组学、代谢组学在兽用中药质量控制及评价中的应用。

5.1 运用代谢组学开展中药过程质量控制 中药质量与有效成分的组成、含量、产地和种属等因素直接相关,传统的分析技术很难对多成分的中药做出正确分析。代谢组学是基于药物整体性的检测技术,能对中药的品种栽培、产地加工、饮片炮制、分离纯化等各个生产加工环节进行质量管控,是临床用药安全性和中药质量控制的有利手段[32]。

应用代谢组学对影响药材质量的关键因素进行分析,提供代谢产物的整体信息,确定与质量变化相关的质量标志物,为中药材的质量控制和炮制提供重要依据。中药品种鉴定是中药质量控制的关键,通过代谢组学差异研究,可广泛应用于代谢信息相似的中药质量控制,实现对多种同属植物进行化学成分分析和真伪鉴别。生长年限是影响中药成分的重要因素,直接关系药材各成分的含量和药效,随着中药栽培时间的延长,通过研究代谢物含量变化,揭示客观的量效关系。此外,中药炮制是中药材采收之后处理加工的重要环节,炮制过程中化学成分发生改变,运用代谢组学可对发生改变的成分进行综合分析,通过研究代谢产物的空间分布,筛选差异代谢物,进而揭示炮制减毒增效的物质基础[33]。

5.2 运用基因组学探索中药药性与功能主治关系中药基因组学是从基因组水平研究中药及其对人体作用的一门前沿学科,利用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络,阐明中药防治人类疾病的分子机制[34]。经过不断发展,中药基因组学已成为开展中药有效成分筛选、中药及复方药性研究、中药新药研发、中药质量控制与安全性研究及中药基因芯片构建的基础与重要依据。

中药是在中医药理论下指导运用的药物。中药的基本理论,部分与现代医学有一定相关性解释,如活血化瘀、行气止痛、清热解毒等,可以优先考虑进行生物活性测定,不强求完全反应中药的本质特点,但可以达到以良好的生物效应控制标准符合国际公认的质量准则,从而推动中药在临床中的使用,并推动中药质量标准的进步。对于中医药基础理论,如寒热温凉、中医证候的辨证论治,其本质也是一种生物体的过程和反应,那么就可以通过基因组学、蛋白组学等方法,从分子生物学基因层面阐述中药药性、作用机制,通过建立全新的生物检定方法,进一步探索中药的药性与功能主治的关系[35],为中医药理论文化的继承与发展提供有效技术支撑。