基于网络药理学和生物信息分析研究土茯苓抑制结直肠癌的作用机制及实验验证*

王梦琦,董思进,朱子焕,罗丽丹,周燕红,刘毅飞**

(1．湖北科技学院医学部,湖北 咸宁 437100;2．湖北科技学院医学部药学院)

每年全世界结直肠癌(CRC)的发病率和死亡率都很高,中国CRC的流行现状亦不容乐观。结直肠癌好发于老年人[1],随着我国人口老龄化的加速,疾病负担将会越来越严重。

在我国,土茯苓以野生为主并且资源丰富,具有解毒、通利关节等功效[2]。现代药理也已经证明土茯苓具有提高人体免疫机能、抗痛风、保护心血管、抗肿瘤、保肝等重要作用[3]。目前针对土茯苓的分子机制和抗癌活性的分子靶点研究较少,我们通过网络药理学和生物信息学分析研究土茯苓抑制结直肠癌的作用机制,并检测土茯苓核心成分豆甾醇对直肠癌细胞增殖的影响,为结直肠癌的临床研究及治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 筛选土茯苓的活性成分及潜在靶点

利用中医药系统平台(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索土茯苓的相关活性成分,并将口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,类药性(drug-likeness,DL)≥0.18作为初步筛选标准来获得活性化合物及其作用靶点。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“药物-活性成分-作用靶点”网络图。

1.2 结直肠癌疾病的相关靶点

以“colorectal cancer”为关键词,在Gene Cards数据库(https://www.genecards.org)、OMMI数据库(http://www.omim.org)中检索与结直肠癌相关的靶点,将所得靶点合并后删除重复靶点。在Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线网站绘制韦恩图,获得土茯苓和结直肠癌的交集靶点。

1.3 GO和KEGG富集分析

使用DAVID数据库进行GO注释分析和KEGG分析。GO注释分析包括生物学过程 (biological process,BP)、细胞组成(celluar component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。最后将GO富集结果绘制成条状图,KEGG富集结果绘制成气泡图。

1.4 蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建

利用Cytoscape软件进行药物有效成分及靶点的网络拓扑参数分析,选取连接度大于三倍中位数为关键活性成分,在STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)平台分析PPI互作关系。

1.5 核心靶点的确定

将1.4中的潜在作用靶点分别导入GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)(http://cancer-pku.cn)和TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)数据库。以P<0.05具有生物学意义为检验标准,查看靶点在癌症组织和正常组织中的表达、生存预后以及与免疫细胞浸润的相关性,筛选出核心靶点。

1.6 核心靶点与免疫浸润的关系

将1.5中获得的核心靶点导入TIMER数据库,分析此基因与免疫细胞浸润的相关性。

1.7 分子对接验证

将大分子蛋白质CASP3设置为受体,将土茯苓最强活性成分diosgenin(薯蓣皂素)设置为小分子配体,运行Autodock软件进行分子对接获得核心靶点与主要化合物的结合能,利用Pymol对结果进行可视化。

1.8 体外实验验证

选取土茯苓中具有较强活性成分的豆甾醇作为实验药物进行MTT实验验证研究。

1.8.1 实验材料

豆甾醇、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)均购于上海源叶科技有限公司,胎牛血清、Lovo细胞均购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.8.2 MTT检测细胞增殖能力

将对数生长期的结直肠癌Lovo细胞以每孔8000个铺在96孔板中。每孔密度培养至80%时,分别加入浓度为0、62.5、125、250、500μmol/L的豆甾醇处理24h,避光情况下每孔加入10μL的MTT溶液,用酶标仪处检测吸光度值(490nm)。细胞存活率=平均实验组OD值/平均正常对照组OD值,且设正常对照组存活率为1。MTT实验需重复3次,并用Graphpad prism 8.2软件进行分析。

2 结 果

2.1 土茯苓活性成分及作用靶点

在TCMSP数据库中共检索得到土茯苓活性成分(BO≥30%,DL≥0.18)15个如表1,活性成分作用靶点893个。再将靶点在中文蛋白资源库中获得基因ID,删除重复值后共获得土茯苓潜在作用靶点369个。将土茯苓的15种活性成分及潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2构建“药物-活性成分-作用靶点”网络图(图1)。网络拓扑学分析结果显示,土茯苓中槲皮素、柚皮素、豆甾醇中度值较高,这些活性成分可能成为土茯苓对结直肠癌发挥疗效的主要原因。

注:橙色菱形为药物活性成分,蓝色方形为潜在作用靶点。

表1 土茯苓活性成分

2.2 药物-疾病共同靶点

汇总Gene Cards数据和OMIM数据库中与结直肠癌相关的靶点,最终共得到10 418个相关靶点。再与土茯苓活性成分靶点取交集后,共得到疾病-药物共同靶点共264个(图2)。

图2 疾病与药物成分靶点韦恩图

2.3 GO和KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8对264个土茯苓与结直肠癌共同靶点进行生物富集分析,得到GO功能富集条目1004条,其中,生物过程754条、细胞组成84条和分子功能166条。根据GO富集结果,对P值排名前10的通路进行作图(图3)。GO富集结果显示共同靶点主要与磷酸化蛋白结合(phosphoprotein binding)等生物学过程(BP),与细胞间小管(intercellularcanaliculus)等细胞组成(CC),以及对外源dsDNA的反应等分子功能(MF)过程密切相关。在DAVID数据库中筛得KEGG通路142条,绘制P值排名前10的KEGG气泡图(图4),结果表明,共同靶点主要富集在Hipposignaling pathway、Pancreaticsecretion、Salivarysecretion等通路中。其中气泡面积的大小与该信号通路的显著性呈正相关,气泡的颜色代表P值的大小。

图3 GO富集分析图

图4 KEGG富集分析图

2.4 PPI网络分析

在STRING数据库中对交集靶点进行PPI分析,自定义“custom value”为2.0后,共得到节点数264个,边缘数274个,平均节点度2.08。利用Cytoscape3.7.2软件和Network Analyzer工具分析药物网络中节点的度值,中度值(Degree)越大,节点越大,节点颜色越深。其中度值的中位数为33,选取连接度>99(三倍中位数)的成分为核心成分(图5)。

图5 核心成分网络图

2.5 核心靶点获取结果

将2.4中的核心成分进行生物信息学分析,最终筛选核心靶点为CASP3。在泛癌中发现CASP3基因在COAD(P<0.001)、BLCA(P<0.001)、BRCA(P<0.001)、READ(P<0.001)等肿瘤中高表达(图6A);与正常结直肠组织相比,CASP3基因在结直肠癌组织中高表达(P<0.05)(图6B);从生存曲线来看(P=0.033<0.05)预后较差,并且随着时间的增长,CASP3基因的表达差异显著增大(图6C)。从而提示CASP3可能作为预测结直肠癌预后的有效生物标志物。

图6 生信分析图

2.6 核心靶点与免疫浸润的相关性

免疫细胞浸润水平与癌细胞的增殖呈正相关。TIMER数据库中显示CASP3与B细胞(r=0.296,P=1.24e-09)、CD8+T细胞(r=0.516,P=4.74e-09)、巨噬细胞(r=0.237,P=1.45e-06)、嗜中性粒细胞(r=0.371,P=1.44e-14)、树突状细胞(r=0.368,P=2.49e-14)细胞的浸润水平呈显著正相关(图7)。结果提示CASP3可能作为结直肠癌中主要的肿瘤免疫浸润调节因子。

图7 基因表达和免疫浸润比例之间的关系

2.7 分子对接验证及可视化结果

Autodock对接结果显示,小分子药物薯蓣皂素与CASP3蛋白对接结合能为-8.04kcal/mol,表现为强烈的结合活性,并利用Pymol软件进行可视化(图8)。

注:彩色条带为蛋白质分子,红色棍状结构为配体分子,黄色虚线为连接的氢键,彩色标签为配体分子对接的氨基酸残基。

与正常对照相比,**P<0.01

2.8 MTT实验结果

通过MTT实验检测豆甾醇对Lovo细胞增殖能力的影响。观察不同浓度的豆甾醇作用Lovo细胞24h,随着豆甾醇给药剂量的增加,Lovo细胞活力下降且数量减少,与正常对照组相比,62.5μmol/L没有统计学意义(P>0.05);125、250、500μmol/L均有统计学意义(P<0.05)。结果表明豆甾醇可抑制Lovo细胞增殖,且具有浓度依赖性。豆甾醇作用于Lovo细胞的IC50值为209.8μmol/L(图9)。

3 讨 论

根据TCMSP分析结果显示,土茯苓核心活性化合物共15种,其中槲皮素、豆甾醇、柚皮素中度值较高,可能起着主要作用。槲皮素是一种黄酮类化合物,其抗炎作用主要是通过激活AMPK的磷酸化及抑制促炎因子发挥作用[4]。豆甾醇是一种不饱和植物甾醇,具有抗炎、抗癌、抗氧化等药理作用,容易通过取代和加成反应合成衍生物。目前,有研究证实豆甾醇衍生物对乳腺癌细胞具有细胞毒作用[5]。对于子宫内膜癌,豆甾醇通过抑制IGF1R/Akt/mTOR通路抑制EC细胞的细胞周期进程、迁移和肿瘤干细胞活性[6]。动物实验研究显示,豆甾醇可以通过抑制P物质减轻哮喘小鼠的气道炎症和高反应性[7],也可抑制肝脏NLRP3炎症小体和IL-18基因的表达起到对小鼠脂肪性肝炎的保护作用[8]。柚皮素具有多种功效,主要作用于炎症和肿瘤疾病[9]。土茯苓的提取物具有较好的抗氧化能力,可以显著清除自由基,其提取物对酪氨酸酶也具有激活作用。土茯苓还可通过血小板活化、破骨细胞分化、cAMP等信号通路治疗类风湿性关节炎[10]。由此可见,土茯苓在抗炎、抗氧化和抗肿瘤中发挥重大作用,也为土茯苓治疗结直肠癌发挥作用提供了很大的可能性。本研究MTT实验结果显示,土茯苓核心成分豆甾醇抑制Lovo细胞增殖,且具有浓度依赖性。

CASP3是放射治疗或免疫治疗期间激活的细胞凋亡的主要介质。CASP3在癌症的发生及发展中起着重要作用,在多种癌症中均为高表达[11]。从PPI网络和药物疾病靶点之间相关的紧密程度推测土茯苓可能通过众多途径的协调来调控对结直肠癌的作用。利用拓扑分析度值和节点的大小初步删选,选取连接度大于三倍中位数为初步核心成分。生信分析核心基因在不同癌症组织和癌旁组织中的表达特异性提示核心基因在结直肠癌组织中的特殊性。通过分析CASP3基因在泛癌中高表达,在结直肠癌细胞中,与正常组织相比,亦呈高表达水平。此外,CASP3基因的表达与多种免疫细胞的浸润水平是正相关的,提示CASP3可能作为结直肠癌中主要的肿瘤免疫浸润调节因子。从生存曲线中反映此基因的生存预后较差,且在不同时期表达有显著差异性,提示CASP3可能作为预测结直肠癌预后的有效生物标志物,为土茯苓靶向CASP3治疗结直肠癌提供了可能。GO功能富集分析显示,共同靶点主要与磷酸化蛋白结合(phosphoprotein binding)等生物学过程(BP),与细胞间小管(intercellular canaliculus)等细胞组成(CC),以及与对外源dsDNA的反应等分子功能(MF)密切相关,在KEGG富集分析中,富集最为显著的为Hippo signaling信号通路。最后,采用分子对接技术验证对接活性,小分子药物与CASP3蛋白对接结合能为-8.04kcal/mol表现为强烈的结合活性。从而得出结论,土茯苓可能靶向调节CASP3蛋白从而抑制结直肠癌细胞的增殖。

本研究通过网络药理学和生物信息学分析土茯苓可能通过靶向调节CASP3通路从而抑制结直肠癌,土茯苓核心成分豆甾醇抑制直肠癌细胞增殖。本课题组将进一步实验研究土茯苓抑制结直肠癌的可能机制,为土茯苓治疗结直肠癌提供新的思路和方法。