高通量测序技术在海关监管中的应用概述

陈莉 郑耿东 周广彪 周连柱 张峥嵘 温尔英 利光辉*

（1.汕头海关技术中心 广东汕头 515041；2.中国农业科学院植物保护研究所）

0 引言

近年来，高通量测序技术的质量不断提高，速度不断加快，成本不断降低，被广泛应用于许多生态位中的整个原核生物群落。 第一代测序技术是由Frederick Sanger 于1977 年在选择性加入链端双脱氧核苷酸的基础上开发的[1]。 Sanger 测序采用DNA复制原理，由于缺少羟基基团，不具有与另一个脱氧三磷酸核苷酸连接形成磷酸二酯键的能力， 这些双脱氧三磷酸核苷酸可用来终止DNA 链的延伸。 此外， 这些双脱氧三磷酸核苷酸上连接有放射性同位素或荧光标记基团， 因此可以被自动化仪器或凝胶成像系统所检测到[2]。

一代测序是一种经过验证的测序技术， 具有高准确性和可靠性。相比其他测序技术，一代测序可以直接测序较长的DNA 片段，有利于研究基因组结构和功能的重要区域。一代测序的准确性较高，适用于研究较小的DNA 片段以及研究基因组结构和功能的重要区域，如寻找个体间遗传差异、鉴定个体间的核苷酸突变等。尽管如此，一代测序技术相对于后续代的测序技术，需要更长的时间来完成测序过程，成本较高，不适用于大规模测序项目。虽然目前一代测序在市场占有较大比重，但其存在测序通量低、维护成本高等难以避免的缺陷， 已无法满足日益增长的测序需求，随着科学技术的飞速发展，新一代测序技术应运而生。

二代测序技术相较于一代测序而言准确率稍有降低，但通量和产出大大增加，可以同时针对多个样本进行测序，较一代测序实现了数量级增长[3]。 二代测序技术是基于PCR 和基因芯片发展而来的DNA测序技术，引入可逆终止末端，从而实现边合成边测序。二代测序在DNA 复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊荧光分子标记来确定DNA 的序列。 由于在二代测序中，单个DNA 分子必须扩增成由相同DNA 组成的基因簇， 然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA 序列[4]。 二代测序相比于一代测序方法具有许多优势。 二代测序可以同时解读数百万到数十亿个DNA 片段，大大提高了测序速度和效率。 通过多次重复测序和专业的分析算法，可以减少测序误差，提高结果的准确性。 由于高通量的特点，每个样本的测序成本大幅降低，使得研究人员可以更容易地开展大规模测序项目。 二代测序可用于不同大小和类型的DNA 或RNA 样品，适用于基因组测序、 转录组测序、 外显子组测序、ChIP-Seq 等多种应用场景。 其可以提供丰富的信息，包括序列、甲基化状态、染色质亚型等，为深入理解基因组功能提供了更多的维度。 由于二代测序产生的数据量大， 需要消耗大量的计算资源和存储空间，并需要复杂的数据处理和分析流程。二代测序在单次测序长度上存在一定限制， 尤其是短读长测序技术， 对结构复杂的基因组部分需要进行拼接和重组，可能会引入一定的误差。对于高度重复性较高的基因组区域（如全基因组DNA 甲基化测序），二代测序可能面临难以解决的挑战。 目前二代测序主要应用于基因组学、 转录组学、 微生物学等相关方面研究。其高通量、低成本和丰富的信息输出为深入理解基因组功能和疾病机制提供了强大的工具。

目前二代测序平台主要由罗氏454 焦磷酸平台、Illumina 测序平台、SOLiD 高通量测序仪[4]和Ion Torrent 和华大智造。 罗氏454 测序平台，是基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统， 通过合成反应而测序的原理进行测序，其具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点，主要应用于物种基因文库构建、 分子进化研究领域的应用和功能验证等领域的应用。 Illumina 测序仪通常也被称为Solexa分析仪，基于可逆终止的、荧光标记dNTP，实现边合成、边测序的化学反应，测序精准度高等优点，相较于Roche454 测序平台，其读长在100～150 bp 之间，主要适用于甲基化和表观遗传学研究[5]。SOLiD 高通量测序技术是四种荧光标记寡核苷酸的连接反应测序，由于其读长序列为50～75 bp，具有较高的精确度，主要应用于基因重测序和SNP 检测。Ion Torrent是一种基于离子探测技术的二代测序方法。 其原理基于DNA 聚合酶催化单核苷酸加入模板DNA 链，并通过监测释放的氢离子来测量DNA 合成过程。Ion Torrent 测序通过离子探测技术实现高通量、快速且相对低成本的二代测序。然而，由于其特殊的原理和技术限制， 其在一些应用场景中可能存在一些劣势。华大智造的二代测序平台，基于Illumina 测序技术进行数据获取和分析。具有高通量、高准确性和多样性及应用广泛等方面的优势， 但在数据处理和微少突变检测方面仍存在一些劣势。

显然一代测序和二代测序仍然具有一定的局限性，现代科技的迅速发展，生物测序技术也已发展到了三代测序，即指单分子测序技术。DNA 测序时，不需要经过PCR 扩增， 实现了每一条DNA 分子的单独测序。同时可实现DNA 或RNA 的直接测序，减少前期样本的逆转录和扩增步骤，实现高通量，长读长的全长测序[6]。

三代测序技术能够实现更高的测序产量， 可以同时测序多个样本，提高测序效率。相较于二代测序技术，三代测序技术可以产生更长的读长，从而提供更多的碱基信息， 有助于解决基因组重复序列和结构变异等难以分析的问题。 三代测序技术能够实时监测DNA 合成的过程，不需要后续测序操作，可以提高测序速度。与二代测序技术相比，三代测序技术在读取过程中存在较高的错误率， 可能需要额外的校正和纠错步骤，在数据质量较低的情况下，分析和组装基因组或转录组等可能存在一定的困难。 目前三代测序技术可以提供更长的读长， 有助于研究古生物学中的基因组变化和进化。 适用于涉及基因组结构变异和重复序列的问题， 以及需要更全面的遗传信息分析的研究领域。

在新冠疫情流行防控中， 三代测序技术对病毒的基因组进行全面、快速的测序分析。这种高通量的测序技术可以大大缩短病毒序列的获取时间， 从而提供了更及时的疫情监测和溯源能力。 通过对新冠病毒基因组的深入研究， 可以帮助人们更好地了解病毒的传播特征、变异规律等重要信息，为抗击疫情提供科学依据。以新冠疫情为例，通过对入境人员的呼吸道样本进行三代测序， 可以快速准确地检测出是否感染新冠病毒，并判断其感染的病毒株。这对于早期发现病毒输入， 及时采取相应的防控措施具有重要意义，有效遏制疫情传播。

综上所述，高通量测序技术因其具有通量高，检测基因数目多，可以进行全基因组测序；灵敏度高，可检测低至1%甚至0.01%的突变，还可以一次性检测多种不同类型的突变等突出优势， 已逐渐应用到我国各个行业领域，尤其在海关应用，不仅加快通关速度/缩短通关时间， 加深了国门生物安全技术储备，展现了出入境检验检疫工作的新局面，更有效提升了海关的社会公信力。

1 高通量测序技术在动物检疫中的应用

动物检疫是对可以或已证实的疫病对象实行强制隔离，或作出适当处理，目的是防止动物传染病的传播，保障畜牧业生产和人民健康[10]，其包括动物疫病（陆生和水生）、病原微生物等。当前动物疫病检测主要从病理学、血清学和分子生物学等角度出发，一般传统检测方法居多[11]，由于样品信息有限，传统检测方法周期较长，或依据经验，形态特征，电镜等很难区分非典型性状。动物疫情发展与变化的多样性，疫情呈现出预测难度大、爆发突然、传播速度快、范围广等的特点，如何获取病原信息，真实反映病原样本数据是各地卫生部门工作的重点。 有最新研究表明生物传感器较传统方法，更具有智能化、微型化和功能多样化等优势， 但由于生物传感器在操作过程中容易出现假阳性，检测率不准等问题，仍然有待进一步提高[12]。目前，高通量测序技术的发展已经十分成熟，水生动物疫病种类多样，病原体都有其基本的基因特征，结合高通量测序的数据信息分析方法，得到分析结果，对动物疫病的防治起到积极作用[13]。高通量测序综合其特有的信息量全， 高效准确等特点为动物检疫工作带来利用价值， 并通过对原有技术的比较，重点探究了高通量技术的实际应用。

蒋立立[14]研究报告指出，高通量测序技术可以对待测病原微生物的完整基因组进行测序和分析，获得DNA 序列， 从而快速精准鉴定出未知病原体，揭示其变异和进化规律，为提高通关争取时间效率，同时提高技术水平， 打造一支高精尖技术团队；URABAN 等[15]采用宏基因组测序技术对本地微生物群落进行调查，了解病原微生物组成和水体污染情况；张浩博等[16]研究显示传统的水生动物疫病鉴定，不能很好的满足海关的检测需求， 而高通量测序技术适用于海水鱼类生物量评估研究， 被广泛应用于水生生物的鉴定和多样性评估； 高通量测序技术不仅在物种多样性和生物量评估的研究上提供了明确的方向及有力的工具， 而且也更有利于检疫结果的准确性与可靠性，从而提高检疫技术水平，加强检疫工作。当前动物检疫设备性能不佳，不利于开展动物检疫工作，难以保障动物检疫工作结果的真实性。孙涛等[17]研究表明，高通量测序以宏基因组学的数据解析可有效获知病原信息， 能有效监控复杂病毒样品并协助寻找传染溯源的有效手段， 因此高通量测序在动物检疫中的应用是我们未来研究方向重点。

近几年高通量测序技术的应用拓展深化了科学研究领域的视野， 高通量测序技术的应用对物种的分类学鉴定，未知物种的鉴定，促进对病原群落中生物多样性的研究，高通量测序的灵敏性、可操作性方面的优势不仅会拓宽动物检疫研究领域的发展，也会加快数据的处理， 为预防动物疫病传播可行性提供重要方向。

2 高通量测序在植物检疫中的应用

高通量测序技术在植物病毒学领域的应用开始于2009 年，并已被证明在病毒的发现和检测方面非常成功，病毒已在大多数植物中被鉴定出来[18]，应用高通量测序技术可快速获得植物病毒的基因组序列，现已成为检测植物病毒的主要手段，为植物病毒的防治提供依据[19]。 检疫性病菌一直是国门生物安全的重点，胡佳续等[20]首次利用高通量测序技术，并结合对大豆中真菌多样性观察研究， 为截获重要病原真菌和评估美国大豆输华有害生物风险提供重要参考。 高通量测序技术对进境澳大利亚小麦上病原真菌检测研究分析得到可分类OTU 共622，基于不同分类水平分属于5 个门，64 个目，201 个属， 该技术将成为一项常规分析技术， 为检疫性病原微生物的多样性研究发挥重要作用[21]。 周密密等[22]研究表明通过高通量测序技术全面筛查进境高粱携带的病原真菌种类，能够检测出多种高粱病原真菌，快速筛查高粱病原真菌提供技术指导， 为口岸风险评估技术支持。

为防止植物危险性病、虫、杂草等有害生物由国外传入和国内传播蔓延，维护对内、对外贸易信誉，履行国际间或国内地区间的义务， 同时对维持生态系统平衡和生物多样性起到重要作用。 经济社会的发展必然伴随着国际间频繁的农业交流， 如种子和苗木调运，水果蔬菜贸易等，一些新的或者外来入侵物种、植物病毒等传入我国的风险加大。高通量测序技术主要进行测序分析， 并且可在一天内得到病毒的样品信息，加快病虫害防治，不仅可以丰富植物病毒公共数据库资源， 而且为植物检疫病毒的积累提供支持[19]。

王雪蔚等[23]研究表明外来病原生物的入侵是全球经济一体化后我国所面临的主要生物风险之一。由于传统的形态学检测高度依赖研究人员经验积累，已不能满足当下社会快速发展的需求， 贸易量不断加大， 我们需求的是能快速准确有效的鉴定出有害生物或病毒，为守护国门提供保障。其中松材线虫属于我国重大外来入侵种并造成严重的经济和生态损失，已被我国列入对内、对外的森林植物检疫对象。不同于传统的形态学鉴定，对常规物种描述的评估，高通量测序克服形态学鉴定和经验的限制， 已快速被应用于松材线虫的研究[24]，越来越多的松材线虫的信息被报道， 高通量测序加深了我们对松材线虫的理解。 丁晓磊等[25]研究表明高通连测序技术对松材线虫关键致病基因的研究，为松材线虫的分子生物学研究提供了重要的基础数据，为疫病的防治提供了方向。 应用高通量测序技术筛查进口植物携带的检疫性病毒，不仅能快速鉴定出已知病毒，对于样品中携带的多个或未知病毒也能一次性鉴定出，有效避免一些病毒的漏检或错检，降低病毒传入的风险，能精准有效防控外来植物病毒的传入，保护国门生物安全[26]。植物检疫检测的种类繁多， 高通量测序技术的不断完善，有助于建立有效的防疫机制，提高预警能力。

高通量测序能以相对较低的成本在短时间内完成样品中所有物种转录组或基因组的测定， 该技术被广泛的应用到植物病毒的诊断中，但检疫性病毒、松材线虫及真菌的分类学研究等方面涉及较少仍有待进一步分析[27]。

3 高通量测序在卫生检疫中的应用

在卫生检疫领域中， 高通量测序可以用于检测和监测病原体，包括病毒、细菌、真菌和寄生虫等。通过测序病原体的基因组， 可以准确地鉴定病原体的种类、亚型和变异情况，有助于及时发现新型病毒或传播途径，提供有效的指导和决策依据。 此外，高通量测序还可以对病原体的耐药性进行分析， 帮助选择合适的治疗方案。 还可以应用于传染病的流行病学调查和溯源研究。 通过测定感染者和潜在传播者的基因组序列，可以追踪病原体的传播路径和来源，为防控措施的制定和实施提供科学依据。近年来，高通量测序还可以用于快速筛查和检测入境动植物及其产品中的有害生物。通过对基因组的测序和比对，可以准确鉴定是否存在具有经济、 生态或健康风险的病原体和有害生物。综上所述，高通量测序在卫生检疫中的应用为疫情监测、 传播控制和卫生安全提供了重要的技术支持， 有助于提高对疾病的早期预警和快速响应能力。

4 高通量测序在食品微生物检疫中的应用

食品安全问题一直是影响我国人民的生命安全和社会稳定的重要因素，因此，进出口食品的检疫工作对我国食品安全有着十分重要的意义， 能够规范我国进口食品行业的发展， 对整个食品检疫工作具有重要意义[28]。食品微生物与人类生活息息相关，由病原体引起各种传染病明显危害到人类健康。 我国食品微生物检疫研究与国际先进水平还存在着明显差距， 食品微生物检疫作为海关进出口中一项重要的食品安全保障技术， 对推动食品产业健康发展具有重要意义[29]。近年来，实现对未知病原微生物的快速准确检测是重大疫情疾控和日常生物安全监督的基本要求， 传统的病原微生物检测一般有显色培养基、ATP 生物发光检测及免疫层析等方法，基于在培养基上有不明显的特征， 采用传统方法很难完全准确鉴定微生物， 这时高通量测序就体现出独特的优势[30-31]。 传统的培养技术只能检测到食品中的优势菌群，但并不能全面的分析菌群群落。高通量测序对食品微生物发酵过程和机制研究主要体现在微生物生理功能、代谢能力和进化。吴林寰等[32]总结了高通量测序技术对基因组合元基因组测序研究及对微生物的发展趋势。一般采用形态学观察，细胞生理生化特征，细胞培养等方法。高通量测序的出现，无需在实验室培养即可全面分析食品微生物；利用16S rRNA基因的高通量测序及传统的微生物学方法来评估细菌多样性， 其次高通量测序直接从食品中提取微生物基因组，并进行基因测序[33]。高通量测序具备传统微生物检测所不具备的优势， 在食品微生物中的检测重要性日益凸显。 杨光萍研究表明高通量测序食品微生物多利用16S rDNA/rRNA，其在微生物菌属的基因结构、功能上高度保守，同时具有长度适中、拷贝量大、易扩增等优点[34-35]。 李桂澜等[36]研究表明16S rDNA/rRNA 高通量测序仍然是用于鉴定食品微生物菌群最常用的技术，与Rajendhran 等[37]研究基本保持一致，但基于技术的优势于缺陷，通常结合传统检测技术手段联合分析病原微生物。 米其利等[38]的研究表明，高通量测序能准确、快速得到微生物中有效信息，极大的缩短了分析时间，并减少传统检测结果的不准确性，在食品微生物多样性，病原菌特征等方面发挥重要作用，且在后期基于数据的研究，更加简便，大大优化传统检测方法。

5 总结与展望

高通量测序作为一种快速、高效、准确的基因测序技术，具备快速、准确、高通量的特点。对潜在的疾病源进行有效检测， 帮助海关筛查和控制潜在的危害；对植物病原微生物、昆虫害虫等进行基因序列分析，实现快速鉴定和分类，提高检疫效率；对食品中的微生物、 源自转基因植物的DNA 等进行准确检测，帮助海关加强对进出口食品的检测和监管；高通量测序技术对病毒、细菌等微生物进行基因组分析，帮助海关识别和追踪疫情的来源和传播路径， 以及设计有效的防控措施； 通过对食品中的基因序列进行分析， 可以及时发现食品中存在的可能对人体健康有害的成分，提高食品安全水平。

高通量测序丰富了检测方法， 为海关明确和分析致病原展现了新途径， 开拓了新型测序技术在海关检验检疫业务的应用场景， 逐步完善病原菌的基因组数据库， 进一步开发高通测序大数据的智能应用，能更好服务海关保国门、促发展的主要职能。