生物技术药物在核化生武器防护中的应用

张英起，郝 强，张 存，顾锦涛

空军军医大学药学系生物制药学教研室，陕西 西安 710032)

核化生武器具有高损伤性、高毒性以及高传染性的特点，不但能造成大规模杀伤效应，而且还能给人们的心理造成极大的震慑。因此，在各国国防体系中，核化生防御都是不可或缺的重要组成部分。随着生物技术的快速发展，其在核化生医学防护中的作用也日益凸显。本文总结了近年来生物技术尤其是防治药物在核化生损伤防护中的应用。

1 生物技术药物与核武器损伤防治

1.1 目前已批准上市的辐射损伤防治生物技术药物

迄今为止，已有4种药物被批准用于治疗核辐射损伤。非格司亭(Filgrastim)是一种重组人粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)[1]，被批准用于各种原因引起的中性粒细胞减少症及其后遗症的治疗、自体造血干细胞的动员以及急性辐射综合征的治疗。在Filgrastim的临床试验中，发现该药物能有效的增加中性粒细胞数量，帮助患者恢复骨髓功能，提高生存率[2]。

Filgrastim的批准对于患者来说是一个重大的突破，为高剂量辐射患者提供了一种新的治疗选择。但Filgrastim半衰期短(仅3.5 h左右)，需要频繁注射给药，难以取得理想的临床治疗效果。因此，研发长效的Filgrastim对急性辐射综合征的治疗至关重要[2]。培非格司亭(Neulasta)是安进公司研发的全球首个可用于治疗辐射损伤的长效G-CSF产品，是一种聚乙二醇修饰的长效G-CSF。与Filgrastim相比，Neulasta被肾脏和蛋白酶清除的程度大大降低，在体内的有效药物浓度会显著延长[2]。

沙格司亭(Sargramostim)是一种酵母衍生的重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)。GM-CSF是一种多系因子，能够刺激各种免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞)生长和活化以及红系增殖。Sargramostim用于急性暴露于骨髓抑制剂量辐射的儿童和成人患者急性辐射综合征造血异常的治疗，以提高生存率。值得一提的是，Sargramostim是首个在辐射暴露48 h后用药能够明显提高生存率的治疗药物[3]。

最新批准的辐射损伤治疗药物罗米司亭是一种通过基因重组生成的肽类的血小板生成素受体激动剂，可刺激巨核细胞和血小板生成，缓解辐射引起的血小板减少症[4]。

从以上4种已批准的药物可以看出，生物技术药物在辐射损伤中的成熟应用，目前还主要集中在功能和治疗效果明确的造血生长因子类药物。

1.2 临床试验阶段的药物

目前有7种辐射损伤相关的防护药物获得了新药研发资格。其中3种是激素类(5-雄甾烯二醇/Neumune、倍氯米松/OrbeShield、染料木黄酮Genistein/Bio-300)，4种是细胞因子类药物(G-CSF、重组人白细胞介素-12/rhIL-12、恩托利莫/Entolimod、雷利西布/Recilisib)[2]。

染料木黄酮(Genistein)是一种植物雌激素类化合物，具有很强的抗氧化作用，并且具有蛋白酪氨酸酶激酶抑制活性。它可以通过清除活性氧自由基，刺激造血干细胞增殖，以及DNA损伤修复等进而发挥放射保护作用[5]。文献显示，口服或注射Genistein均可明显改善60Coγ射线对小鼠的致死效应，预先使用Genistein可以明显提高大动物辐照后的骨髓分化，造血干细胞增殖，进一步改善损伤状态[6]。我们建立了由中草药槐角中提取槐属甙，再将槐属甙酸解成Genistein的制备工艺，获得纯度达到药用级的Genistein单体(纯度99%以上)，并进一步证实了所制备的Genistein单体具有显著的辐射损伤防护作用[7]。

近来研究资料表明，IL-12在抗放射病方面要优于现有的生物制品。在IL-12治疗急性放射性疾病方面进展最快的是Neumedicine公司研发的重组IL-12，商品名为“HemaMax”。临床前药效学实验显示HemaMax对致死剂量辐射的小鼠和恒河猴具有显著的生存保护作用。8～9 Gy全身照射后24 h给予HemaMax，能明显增加存活率以及生存时间[8-9]。

Cleveland BioLabs公司研制的CBLB502是沙门杆菌鞭毛蛋白的衍生物，通过结合靶细胞Toll样受体5和激活NF-κB信号通路，抑制细胞凋亡、清除活性氧和刺激一系列细胞因子相关的基因表达[10]。CBLB502能够显著提高鞭毛蛋白的辐射保护作用，同时降低毒性[11]。

1.3 临床前研究阶段的药物

胰高血糖素样肽-2(glucagon-likepeptide-2，GLP-2)是由末端回肠和结肠的L细胞分泌的一种肠道营养性生长因子。GLP-2对放射损伤后肠上皮细胞具有保护作用。但是GLP-2的血液稳定性差，半衰期短，限制了其在临床的广泛应用[12]。我们利用基因工程技术设计并制备了一种抗酶解的GLP-2二聚体类似物，命名为GLP-2②，动物实验证实，GLP-2② 能够抑制辐射诱导的炎症反应，减少肠道的结构性损伤，促进肠道内隐窝细胞的增殖以及减少辐射诱导肠道细胞的凋亡，且GLP-2② 的作用优于GLP-2单体，目前该药物正在进行临床前研究[13]。

帕利费尔明(Palifermin)是重组人角质形成细胞生长因子除去氨基末端的衍生物，能够促进辐射损伤后黏膜的恢复。Palifermin通过增殖刺激和抗凋亡作用提供保护作用[14]。临床前研究表明，Palifermin能够改善化疗和放疗的黏膜毒性；降低接受放化疗的头颈部癌或其他肿瘤患者的口腔黏膜炎发病率[15]。

成纤维细胞生长因子衍生肽(fibroblast growth factor peptide，FGF-P)能够减低辐射诱导的败血症和出血症状，抑制胃肠道和皮肤综合征。FGF-P抑制剂可增加非小细胞肺癌对放射治疗的敏感性，提示FGF-P对被辐射细胞具有保护作用[16]。但FGF-P在辐射肠道综合征治疗中的作用机制还有待进一步研究。

总之，辐射损伤会涉及多个器官，病理生理学过程较为复杂，临床救治极其困难。因此深入研究辐射损伤的作用机制对于研发高效、低毒的抗辐射药物至关重要。我们发现了X射线修复交叉互补蛋白3、成纤维细胞生长因子2、转录因子YY1及microRNA-103a等一系列潜在的辐射损伤防治靶点[17-18]。目前正在针对上述靶点开展候选药物设计和成药性评价。

2 生物技术药物与化学武器损伤防治

化学战剂按其作用常分为六类：神经性毒剂、糜烂性毒剂、失能性毒剂、全身中毒性毒剂、窒息性毒剂、刺激性毒剂。目前，生物技术药物在防化医学中应用主要集中在神经性毒剂和糜烂性毒剂损伤防治方面。

2.1 神经性毒剂

神经性毒剂是当前毒性最大的一类化学战剂。此类毒剂属有机磷酸酯类化合物，可分为两大类，美军称为G类和V类。G类有沙林、梭曼和塔崩等毒剂；V类有维埃克斯等毒剂[19]。目前，在神经性毒剂方面应用的生物技术药物主要是改造的胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)和神经毒剂降解酶。

2.1.1 改造的ChE ChE在保护人体免受有机磷神经毒剂损害方面发挥着重要作用。ChE依其催化底物的特异性分为乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和丁酰胆碱酯酶，AChE能催化其天然底物乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸[20]。AChE的底物乙酰胆碱是神经冲动传输中的传递介质，有机磷神经毒剂会不可逆的抑制AChE活性，使得乙酰胆碱在神经突触处滞留，导致神经传导异常进而发生毒性损害[21]。密西根大学医学院、以色列生物学研究所等单位都开展了更高效、更稳定的ChE的研发，如应用基因工程方法大量生产ChE。通过酶的定向突变技术筛选抗毒效果更好、稳定性更强的ChE修饰物，通过三维结构和分子模拟技术研究ChE结构和功能关系，达到提高催化效率和研发新型突变体的水解乙酰胆碱的目的等。军事医学科学院毒物药物研究所研制的解磷注射液是一种ChE复能药，在有机磷神经毒剂中毒的临床救治中也展现了良好的效果[22]。

2.1.2 神经毒剂降解酶 我国在化学毒剂降解酶方面做了很多有益的基础性工作。如从曲霉菌和假单胞菌中分离出对有机磷酸酯类毒剂有降解作用的酶，使用重金属Cu2+对该酶进行修饰可显著促进酶活性[23-24]。中国农业科学院团队从被污染的土壤中分离到一株能够高效降解有机磷农药的假产碱假单胞菌，并对其活性成分进行了分离纯化和分子改造，使其底物范围更广[25-26]。美军从20世纪开始一直开展抗化学毒剂水解酶的研究，据ResearchGate网站资料显示，美国国防部下属的Edgewood中心研发了两种能高效水解梭曼、沙林和塔崩等化学战剂的水解酶——OPAA和OPH，并授权Genencor公司进行工业化生产。其目标物是有机磷化合物如G类有机磷神经毒剂、V类有机磷神经毒剂的水解[21]。

2.2 生物技术药物与糜烂性毒剂防护

芥子气，即二氯二乙硫醚，是糜烂性毒剂代表。ELDAD等[27]发现超氧化物歧化酶可对抗芥子气的皮肤毒性。美军已将寻找可对抗芥子气的酶列入了发展计划，将多种民用药物的研究成果应用到芥子气损伤防护中[28]。促进细胞存活和增殖的细胞因子和表皮生长因子也被用来治疗皮肤损伤，能够明显促进创面修复。聚乙二醇修饰集落刺激因子对治疗芥子气损伤导致的血液系统损害有明确治疗效果[29]。

2.3 化学战剂单克隆抗体和疫苗的研制

从20世纪70年代开始，各军事强国都加强了利用化学免疫的方法来防治化学毒剂中毒的研究，即制备针对化学毒素的单克隆抗体和疫苗。化学免疫是通过化学合成制备结构明确的抗原用以诱导机体的免疫应答。化学毒素单克隆抗体和疫苗的研制一度被认为是化学战剂药物防护的一种终极解决方案。

荣康泰对神经性毒剂的抗体做过相当多的研究。先后研究了5种毒剂(T2毒素、对氧磷、梭曼、沙林、维埃克斯)，共50余人工半抗原的免疫效果，其中维埃克斯、沙林抗体为新近制备的抗体[30-31]。荷兰的研究机构报道光气中毒前可注射抗血清预防，中毒后也可注射抗血清治疗。注射经光气处理的肺提取液也可使豚鼠耐受致死量的光气中毒而不出现中毒症状，这是由于变化了的肺蛋白起到了抗原作用[32]。LENZ等[33]制备了针对梭曼的F位点的特异性抗体。JOHNSON等[34]针对同一半抗原的不同表位制备抗体，鉴定出三种单克隆抗体，其中BE2-IA10(BE2)和CC1-IIA4(CC1)两种抗体能和梭曼疏水性Pinacolyl基序产生结合。第三种抗体 #2.ID8.2具有独特的重链和轻链序列针对梭曼的甲基磷酰部分。该抗体能与目前确定的所有化学战剂结合。

1991年，美国报道制得抗砷化物中毒的疫苗，并证实该疫苗可用于主动免疫有效预防小鼠砷化物中毒。疫苗还可用于砷化物中毒前10 min和中毒后30 min的被动免疫预防和治疗[35]。近期还研发了抗可卡因疫苗，该疫苗通过将琥珀酰去甲可卡因与霍乱B蛋白共价连接，并吸附在氢氧化铝佐剂上制成，可有效降低可卡因的成瘾性和毒性[36]。由于绝大多数化学毒剂的分子量太小，免疫原性差，到目前为止，所制备的抗体和疫苗对化学毒剂的亲和力和免疫效果均达不到人体抗毒的理想要求。近年来，美国和俄罗斯等国在加强研究化学毒剂高亲和性的人源化单克隆抗体的同时，也把方向转向研究既能与化学毒剂高亲和力结合，又能催化毒剂水解的抗体酶上。但由于抗体酶的研发难度极大，到目前为止还没有显著进展。

3 生物技术药物与生物武器防护

生物武器是利用病原微生物作为有效杀伤战剂的武器。根据生物战剂的生物学类型可分为六大类：细菌类、病毒类、立克次体类、衣原体类、毒素类、真菌类生物战剂。生物技术尤其是疫苗和抗体在生物战剂损伤防治中发挥着重要作用。

3.1 疫苗在生物战剂损伤防护中的应用

生物防御疫苗是生物战剂损伤有效预防的重要手段。目前，生防疫苗主要以减毒活疫苗、灭活疫苗、类毒素疫苗等传统疫苗为主，近些年也发展了重组亚单位蛋白疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等新型疫苗技术。

3.1.1 减毒活疫苗 尽管世界卫生组织于1980年宣布消灭了天花，但现存天花病毒可能引发的泄漏风险和生物恐怖威胁一直是关注的重点。此外，与天花病毒同属的猴痘病毒，近年来在全球范围内引发猴痘疫情流行，给人类带来巨大公共卫生风险。第三代高减毒天花疫苗研究致力于通过细胞培养多次代传，利用代传过程中的随机突变和蛋白缺失，获取减毒疫苗，代表疫苗有Lister clone 16m8、修饰痘苗病毒Ankara等[37]。

1972年，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准BioPort公司生产的炭疽吸附减毒疫苗BioThrax用于高风险暴露者的炭疽菌病预防。BioThrax是基于“动物(效应)法规”的第一个获得批准的疫苗[38]。但是BioThrax疫苗由于其减毒后免疫原性也大大降低，需要注射三剂才能发挥比较好的免疫保护作用，并且需要每年打一针加强针来保持身体的免疫能力。因此美国军方投诉其遇到生化恐怖袭击事件时给药方案耗时太长。美国政府与Emergent Biosolutions公司达成协议，开发其升级产品NuThrax[39]。

3.1.2 灭活疫苗 灭活疫苗作为一种发展较为成熟的疫苗制备技术，成为新型冠状病毒感染(coronavirus disease 2019，COVID-19)疫苗的重要品类。灭活疫苗通过理化手段使病原体丧失致病性，但仍然保持免疫原性，刺激机体产生免疫反应，安全性较好。灭活疫苗也是我国接种最广泛的COVID-19疫苗种类。目前至少有11种灭活疫苗在世界获批使用[40]。但是灭活疫苗也存在需多次接种，并且制备灭活疫苗需要面临大量病原微生物等问题。因此，对于应对战争中快速反应的需求来说是一种限制。

3.1.3 类毒素疫苗 类毒素疫苗是用丧失毒性而保留免疫原性的毒素所制成的疫苗。肉毒毒素由梭状芽孢肉毒杆菌产生的蛋白质神经毒素毒性大约是氰化物的1 011倍，被归为A类生物战剂。美国DynPort Vaccine Company公司利用酵母表达生产的A和B型二价重组亚单位疫苗rBVA/B联合铝佐剂具有良好的安全性及保护性，目前已经完成Ⅰ/Ⅱ期临床试验[41]。

3.1.4 重组亚单位蛋白疫苗 重组亚单位蛋白疫苗利用基因工程技术将病原体靶抗原插入表达载体质粒，再转入受体细胞大量表达、纯化目的蛋白，刺激机体产生免疫应答，常常需要佐剂增强免疫应答。因不需要纯化大量的毒素再进行灭活，批次之间更稳定，安全性更好，因此，重组亚单位疫苗有逐步取代传统的类毒素疫苗的趋势。2019年，COVID-19暴发后，重组亚单位疫苗作为一个重要的疫苗品类，发展迅速，目前至少有12种重组蛋白疫苗已获批使用，有24种处于Ⅲ/Ⅳ期临床试验阶段[42]。

3.1.5 病毒载体疫苗 2017年，中国国家食品药品监督管理总局批准了利用人5型腺病毒(adenoviral vector 5，Ad5)载体构建的表达埃博拉流行株GP蛋白的腺病毒载体疫苗rAd5-EBOV的新药注册。该疫苗Ⅰ、Ⅱ期临床试验，显示其能成功诱导强烈的体液免疫和细胞免疫应答并且无严重副作用[43]。加拿大公共卫生局用ZEBOV的GP蛋白基因替代水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)的GP基因，制成表达ZEBOVGP蛋白的重组VSV载体疫苗rVSV-EBOV，临床试验证明其拥有良好的保护力[44]。2019年，rVSV-EBOV成为第一个获准在美国上市的埃博拉疫苗。COVID-19大大促进了病毒载体疫苗的发展，在载体使用、接种次数、接种方式上均有很多创新，目前有多种相关疫苗获批上市[42]。

3.1.6 核酸疫苗 核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。2021年，印度批准了全球首个人用DNA COVID-19疫苗——ZyCoV-D，临床试验中发现其对有症状的COVID-19患者保护率为67%[45]。此外，美国先后批准两种mRNA疫苗紧急使用，分别是美国辉瑞/德国BioNTech公司的BNT162、美国Moderna公司的mRNA-1273。Ⅲ期临床试验中，两种疫苗对原始毒株的保护效率均超过90%，远超过了同期上市的其他类型的COVID-19疫苗[40，46]。RNA疫苗两大核心技术是核酸序列修饰和递送载体技术，绝大多数使用及研发中的mRNA疫苗都由脂质纳米颗粒递送。这也是未来我国RNA疫苗发展需突破的关键技术。

3.2 抗体在生物战剂防护中的应用

抗体是生物战剂防护的重要组成部分。2013年3月，美国FDA批准加拿大Cangene公司生产的七价肉毒毒素抗毒素HBAT上市，我国也有抗BoNT马血清的生产，但是马血清多克隆抗体对于人体而言属于异源蛋白，容易引起副作用[47]。2015年，美国FDA批准加拿大Cangene公司的炭疽多克隆抗体上市，该多抗是用曾接种过炭疽疫苗的军人血浆分离纯化而成的，美国政府大量采购，合同经费达1.61亿美元，用于国家战略储备。但是人源的血清多克隆抗体受到供体数量的限制，可提供的血清有限，其应用也受到限制。

随着抗体库技术的日渐成熟，也有实验室应用噬菌体、酵母及核糖体展示技术等直接获得高亲和力和中和活性的人源中和抗体。GSK公司通过噬菌体展示抗体库研发的雷昔库单抗被美国FDA批准上市，2016年Elusys公司研发的奥托昔单抗获FDA批准上市，两种药物均为中和炭疽杆菌毒素保护性抗原，用于成人和儿童的吸入性炭疽病的治疗。

2020年10月14日，美国FDA批准再生元公司开发的三抗体鸡尾酒药物Inmazeb(即REGN-EB3)上市，用于治疗由扎伊尔型埃博拉病毒引起的感染，患者可涵盖成人和儿童感染者，包括感染检测呈阳性母亲的新生儿，这是全球首个治疗埃博拉病毒感染的药物[48]。REGN-EB3是再生元公司利用其自有的基因工程小鼠平台，研发出的三种全人源单克隆抗体混合而成。2020年12月21日，FDA批准Ridgeback Biotherapeutics公司研发的单克隆抗体Ebanga(Ansuvimab-zykl)用于治疗扎伊尔埃博拉病毒感染[49]。

4 结束语

生物技术药物在核化生武器损伤防护中发挥着越来越重要的作用，虽然近年来取得了很大进展，但其治疗效果还不令人满意，因此，需要深入研究探索损伤的分子机制，在此基础上探索新的防治技术和策略，针对损伤的关键靶点研究更有效的防治药物。应用生物技术研究核化生防护药物，应遵循“需求牵引，技术为重”的原则，即研究有必要性，立项有前瞻性，技术有可行性。完善核化生武器损伤防护药物研发的上下游研究平台，首先要建立核化生武器损伤分子机制研究的基础平台，建立核化生致伤新理论，在创新靶点研究上有重大突破。而后要建立重大药物研发的相关技术平台，在创新靶点研究的基础上，实现在创新防治药品研发上的重大突破。此外，还要建立快速制备、生产、储存、运输的新型药物制剂技术平台。形成一个集机制研究、新药筛选、新药研发、快速制备和储存运输为一体的核化生武器损伤防护药品研制的综合性技术平台，大大提升我军核化生武器损伤防护药品的研发水平和能力。