糖尿病肾脏病患者肾脏纤维化与YAP活化水平的相关性分析

冯 岚，杨小娟，陈 杨，刘宏宝，李 妮

(1延安大学附属医院肾脏内科，陕西 延安 716000；2空军军医大学唐都医院肾脏内科，陕西 西安 710038)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率逐年上升，40%的DM患者会发展成慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)，DM已经成为全球终末期肾病的首要原因[1-2]。目前临床上判断CKD进展的可靠指标包括蛋白尿、血清胱抑素C和估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)等[3]。全球改善肾脏病预后组织(Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO)基于eGFR和尿蛋白/肌酐比值(urinary albumin-creatinine ratio，UACR)对CKD进行定义和分期[4]，并得到美国糖尿病协会的认可，将符合CKD标准的DM命名为糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)。这为DKD的筛查和检测提供了依据，但是因肌肉质量和种族带来的估算偏差，其对DKD进展的判断效果仍有待长期评价[5-6]。

目前DKD的肾脏病理分类仍然沿用国际肾脏病理学会的共识，包括肾小球病变分级(Ⅰ～Ⅳ级)、间质纤维化(interstitial fibrosis，IF)和肾小管萎缩(tubular atrophy，TA)评分(IFTA，0～3分)、间质炎症评分(0～2分)、小动脉玻璃样变评分(0～2分)和小动脉硬化评分(0～2分)[7]。一直以来专家们对于DKD的研究主要集中在肾小球损害，但越来越多的证据证实了肾小管间质损害在DKD进展中的重要性。

Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)是经典Hippo信号通路的核心效应分子，可被上游机械信号(如基质硬度增加)激活，促进其核移位并激活靶基因，已成为器官纤维化发病机制中的一个关键因素，包括肾、肝、肺和心脏组织[8-9]。新近的研究证实YAP表达和核移位随着体外水凝胶硬度的增加而增加，而且DKD大鼠肾脏的YAP表达显著高于正常大鼠肾脏[10]。但是迄今为止，尚未见到DKD患者肾脏YAP活化与肾脏纤维化相关性的报道。本研究选择近5年空军军医大学唐都医院经肾活检确诊的58例DKD患者，进行肾组织YAP染色，评估其与DKD患者临床生物标记物和病理分类的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象

回顾空军军医大学唐都医院2017年2月至2022年4月全部行肾活检的2型DM患者，共有66例患者经肾活检诊断为DKD。其中1例合并IgA肾病、2例合并高血压肾损害、1例合并原发性膜性肾病和1例肾小球数<10个被排除，剩下的61例患者按KDIGO指南CKD标准进行分期，1例CKD 4期和2例CKD 5期的患者因例数少而被排除。最终58例患者纳入本研究，按KDIGO指南CKD的eGFR分期标准[5]，DKD患者被分为3组：DKD 1期(n=19)、DKD 2期(n=18)和DKD 3期(n=21)。另选择8例接受肾肿瘤切除术的患者作为对照(对照组)，均无高血压、DM、心血管疾病或急慢性肾脏疾病病史。该研究根据赫尔辛基宣言进行，经空军军医大学唐都医院伦理委员会批准(许可证号：K202211-30)，并征得每个受试者的书面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料获取 由唐都医院CKD管理中心护士调取DKD患者的临床和实验室资料，包括年龄、性别、血压、DM史、24 h尿蛋白(24 h urine protein，24 hUP)、UACR、eGFR、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，Scr)、胱抑素C、血清白蛋白(albumin，ALB)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和糖化血红蛋白(hemoglobin A1C，HbA1c)等。eGFR通过CKD-EPI方程计算[11]。另由2名主治医生对数据进行核对并最终确认准确性和合理性。

1.2.2 病理资料获取 根据病历调取受试病理报告，使用光学显微镜和电子显微镜对肾标本进行评估。按照国际肾脏病理学会的共识进行肾脏病理分类和评分[7]。包括：①肾小球病变分级(Ⅰ～Ⅳ级)：Ⅰ级，基底膜增厚；Ⅱ级，轻度系膜增生>25%(Ⅱa)和重度系膜增生>25 %(Ⅱb)；Ⅲ级，结节硬化(至少一个KW结节)；Ⅳ级：全球硬化>50%。②IFTA评分(0～3分)：0分，IF和TA无受累；1分，IF和TA受累面积<25%；2分，IF和TA受累面积为25%～50%；3分，IF和TA受累面积>50%。③间质炎症评分(0～2分)：0分，无；1分，IFTA区域存在炎症；2分，IFTA区域以外存在炎症。④小动脉玻璃样变评分(0～2分)：0分，无；1分，1个；2分，≥2个。⑤小动脉硬化评分(0～2分)：0分，无；1分，内膜增厚但未超过中膜厚度；2分，内膜增厚并超过中膜厚度。

1.2.3 YAP的免疫荧光染色 对58例肾活检组织石蜡块和8例切除肾的癌旁正常肾组织进行4 μm厚切片，进行免疫荧光染色。石蜡切片脱蜡至水，用EDTA抗原修复缓冲液修复，然后用30 mL/L胎牛血清密封，并与YAP(#14074，Cell Signaling Technology，MA，美国)抗体在4 ℃孵育过夜。PBS洗涤3次后，切片与FITC标记的二抗(GB22303，Servicebio，中国)孵育。并用DAPI(G1012，Servicebio，中国)进行细胞核染色。使用Leica DM2500显微镜(Leica Microsystems，德国)，以盲法为每个切片随机拍摄20幅图像(400倍)，通过Image-ProPlus V.6.0(Media Controbernetics，Bethesda，MD，美国)进行量化。

2 结果

2.1 DKD不同临床分期患者临床资料的比较

在58例DKD患者中，38例为男性，20例为女性，肾活检时年龄为(52.9±11.8)岁。除了HbA1c和FBG之外(P<0.01)，DKD 1期的各项指标与对照组相比无统计学差异。结果显示，DKD 1期患者比DKD 2期(P<0.01)和DKD 3期(P<0.01)患者更年轻且DM病程更短。与DKD 1期相比，DKD 2期患者的Scr(P<0.01)、24 h UP(P<0.05)和UACR(P<0.05)升高，ALB(P<0.05)和eGFR(P<0.01)降低，但是FBG和HbA1c在二者之间未见显著性差异。DKD 3期患者比DKD 2期患者的Scr(P<0.01)和胱抑素C(P<0.01)升高，eGFR降低(P<0.01)，但是其他指标在两组之间未见统计学差异。与DKD 1期相比，DKD 3期患者的Scr(P<0.01)、BUN(P<0.01)、胱抑素C(P<0.01)和24h UP(P<0.05)水平更高，ALB(P<0.01)和eGFR(P<0.01)水平更低，其他指标在两组之间未见显著性差异(表1)。

表1 对照组和DKD患者临床资料比较

2.2 DKD不同临床分期患者病理分类的比较

DKD患者的病理分类数据显示，关于肾小球损伤，DKD 2期和DKD 3期患者的全球硬化比率高于DKD 1期患者(P<0.05)，但是肾小球病变分级在3组之间未见显著性差异。DKD患者均出现明显的肾小管间质损伤，分别有36.8%的DKD 1期、55.6%的DKD 2期和71.4%的DKD 3期患者的IFTA评分为3分，DKD 3期患者的IFTA评分显著高于DKD 1期的患者(P<0.05)。IFTA评分中，TA受累范围在DKD 1期和DKD 2期患者之间无统计学差异，但均低于DKD 3期患者；IF受累范围在DKD 2期和DKD 3期之间无统计学差异，但均高于DKD 1期患者(P<0.05，P<0.01)。此外，DKD 3期患者的炎症评分(P<0.05)和小动脉玻璃样变评分(P<0.01)均显著高于DKD 1期，DKD 2期患者的小动脉硬化评分显著高于DKD 1期患者(P<0.05，表2)。

表2 DKD患者肾脏病理资料的比较

2.3 DKD患者肾组织中YAP的活化

DKD 1期和对照组患者之间肾脏YAP的表达无统计学差异。与DKD 1期患者相比，DKD 2期患者肾小管上皮细胞中YAP表达增加(P<0.01)，且主要分布于细胞质。但是与DKD 2期患者相比，DKD 3期患者肾脏中出现更高的YAP表达和核移位(P<0.01)。重要的是，肾脏YAP表达呈现DKD分期依赖性的点对点增加(图1)。

A：YAP在对照组和DKD患者肾石蜡切片中的表达，用共聚焦扫描显微镜拍摄；B：用ImageJ对YAP的相对荧光强度进行定量并分析。YAP：Yes相关蛋白；DKD：糖尿病肾脏病。标尺为200 μm。 bP<0.01。图1 对照组和DKD患者肾小管上皮细胞中的YAP表达

2.4 DKD患者肾组织YAP水平与临床资料的相关性

DKD患者肾组织YAP水平与临床资料的相关性分析结果显示(表3)，YAP水平与eGFR呈高度负相关(r=-0.854，P<0.01)，与Scr(r=0.849，P<0.01)、胱抑素C(r=0.717，P<0.01)呈高度正相关。类似地，eGFR与Scr(r=-0.884，P<0.01)、胱抑素C(r=-0.753，P<0.01)呈高度负相关。

表3 DKD患者eGFR水平和肾组织YAP水平与各临床指标的相关性

2.5 DKD患者肾组织YAP水平与病理分类的相关性

DKD患者肾组织YAP水平与病理分类的相关性分析结果显示(表4)，肾组织YAP表达与IF受累范围(r=0.613vsr=-0.482)、TA受累范围(r=0.633vsr=-0.542)和IFTA评分(r=0.522vsr=-0.377)的相关性显著优于eGFR水平。肾小球病理分级、全球硬化比率、炎症评分、小动脉玻璃样变评分和小动脉硬化评分与YAP和eGFR的相关系数∣r∣均<0.4。因此我们认为与DKD患者eGFR显著相关的是肾小管间质损伤而不是肾小球病变，肾脏中YAP水平与eGFR下降具有明显相关性，在肾小管间质纤维化评估方面优于eGFR水平。

表4 DKD患者eGFR水平和肾组织YAP水平与临床指标和病理分类的相关性

3 讨论

越来越多的证据表明肾脏间质纤维化在DKD发生发展中的作用[1]。在不同脏器损伤的纤维化中显示了Hippo-YAP信号通路的作用[12-16]，但是临床上尚未见到肾脏YAP水平在DKD患者进展风险方面的报道。我们团队新近在DKD大鼠模型中证实了肾脏YAP的活化与肾脏纤维化密切相关[10]。本研究进一步在DKD患者肾组织中评价了肾脏YAP水平与DKD进展风险和肾脏纤维化程度的相关性，主要包括以下亮点：①随着KDIGO指南CKD分期进展，DKD患者肾脏YAP水平呈CKD临床分期依赖性地点对点增加；②YAP水平与TA/肾脏纤维化病理分级的相关性显著优于eGFR。

YAP是经典Hippo信号通路的下游效应器，在急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)和CKD的发病机制中发挥重要作用[12，17]。研究显示YAP的功能依赖于其活化的时间[16]。在AKI中，YAP的激活促进细胞增殖和抗凋亡作用，但是YAP长期过度活化导致细胞去分化，从而促进纤维化进展[18]。在应对长期病理刺激(如高血糖症)时，Hippo途径的失活导致转录调节因子YAP去磷酸化，从而驱动YAP的核转运，在细胞核内与转录增强相关结构域家族转录因子(TEAD 1-4)结合，调节下游靶基因的转录，最终导致肾脏适应性不良修复和纤维化[8]。YAP的药理学和遗传学抑制可以逆转成纤维细胞活化和上皮间充质转化，从而延缓肾小管IF[19-22]。本研究证实了DKD患者肾脏YAP表达和核移位随着CKD分期加重而增加，且与eGFR水平呈显著负相关，与Scr和胱抑素C呈正相关，提示YAP在DKD进展风险中的作用。

目前临床上DKD患者行肾活检仅限于非典型表现者，因此一般选择功能学改变(eGFR和UACR)来判断患者进展风险。行肾活检DKD患者，其病理分类仍然沿用国际肾脏病理学会的共识，包括肾小球病变分级、IFTA评分、间质炎症评分、小动脉玻璃样变评分和小动脉硬化评分。相对严重的肾小球疾病肾活检标本中，肾小球硬化(glomerulosclerosis，GS)和IFTA与eGFR相关[23-25]。新近研究显示当eGFR>60(mL·min-1·1.73 m-2)时，eGFR与GS和IFTA的相关性较弱[26]，而在eGFR>30 (mL·min-1·1.73 m-2)的DKD人群中本研究得到了相似结论。本研究中，即使处于CKD 1期和CKD 2期，也有36.8%～55.6%的DKD患者的IFTA评分为3分，提示了肾小管间质损害在DKD中的重要性。并且无论是eGFR，还是肾组织YAP水平，均显示与肾小球病变(肾小球病变分级和全球硬化比率)较弱的相关性。此外在肾小管损伤方面，YAP水平与肾小管间质损伤，包括IF受累范围(r=0.613vsr=-0.482)、TA受累范围(r=0.633vsr=-0.542)和IFTA评分(r=0.522vsr=-0.377)的相关性明显优于eGFR，这进一步提示肾组织YAP水平在预测肾纤维化中的作用。

本研究尚存在一定局限性，本研究为单中心设计，样本量有限。最重要的是，所选病例均是存在不典型症状的肾活检DKD患者，他们大多数存在尿蛋白快速增加或肾病综合征表现，因此我们不能确定未经肾活检的DKD患者YAP水平与eGFR等临床分级和IFTA等病理分级的相关性是否与本研究的结论一致，因此开发Hippo-YAP信号通路相关的血/尿生物学标志物在临床上更适用于未经肾活检的DKD患者的评估。此外，因为所选病例为近5年的DKD患者，尚缺乏YAP对DKD患者长期预后预测价值的数据。因此，对患者长期随访，并观察YAP水平与每年eGFR下降率、终末期肾脏病的发生和是否死亡等指标的相关性，有益于进一步判断其在DKD患者预后中的预测价值。

总之，本研究在经肾活检的DKD患者中证实，YAP水平显著关联eGFR，其与肾小管间质损害的关联性优于eGFR，提示DKD患者肾小管结构性损伤早于eGFR预测，YAP的组织学分析可能是DKD肾脏纤维化评估的一种补充方法，有待进一步研究。