人真皮微血管内皮细胞的分离、纯化、鉴定研究进展

董瑞娜，王炳坤，吕雅洁，曹天宇，张衍国

空军军医大学唐都医院皮肤科，陕西 西安 710038)

血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)是血管管腔内侧的单层细胞，可以感受血液中的信号并及时做出反应。同时VECs在血管生成、血管内外物质交换和凝血等方面都扮演着重要角色[1]。不同解剖部位VECs在结构和功能上存在明显异质性[2]。例如，在结构上，大脑血管中连接紧密的内皮细胞有助于血脑屏障的形成，而不连续的内皮细胞排列则构成肝脏的窦状结构以促进物质交换[1]。在功能上，免疫方面，皮肤微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells，MVECs)高表达免疫相关分子人类白细胞抗原-Ⅱ(human leukocyte antigen-Ⅱ，HLA-Ⅱ)，可作为非专职型抗原呈递细胞启动免疫应答[3]；而肝窦VECs高表达清道夫受体，使其具有更强的内吞活性[4]，可吞噬血液中的脂质和可溶性抗原等[5]，促进炎症信号的传导。在代谢方面，真皮、肝脏和胃肠道VECs多倾向于氧化磷酸化途径，而糖异生途径在大脑和子宫VECs中更为活跃。通过RNA测序分析，证实了哺乳动物内皮细胞之间存在明显的器官差异性[6]。因此，要准确反映疾病特征，应针对性培养相应部位的VECs，就皮肤疾病而言，应获取皮损部位的原代MVECs进行培养。

许多皮肤疾病的发生发展与血管关系密切，如银屑病、毛细血管瘤、硬皮病、瘢痕疙瘩等[7-10]。但目前，原代MVECs较难分离、纯化困难且易伴随其他细胞污染，对皮肤疾病发病机制的研究造成一定阻碍。因此，本文结合我们自身实践，对当前文献报道的真皮MVECs的分离、纯化与鉴定方法以及其优缺点等内容进行总结，旨在为读者选择合适的方法提供参考。

1 真皮MVECs的分离

1.1 组织块贴壁法

使用组织块贴壁法培养人真皮MVECs的具体方法为：真表皮分离后，将修剪成合适大小的组织块贴附于预先用培养基湿润的培养皿中，于细胞孵箱静置数小时后加入培养液，待组织块周边有细胞游离爬出后将组织块去除[11]。

该方法经济且易操作，但因真皮组织中成纤维细胞为优势细胞，易于生长，会对MVECs的生长产生抑制作用，易造成培养过程中大量成纤维细胞污染。我们在实验中发现，爬出的大部分细胞为成纤维细胞，MVECs很难爬出，考虑可能与其位于血管管腔内侧，难以贴壁有关。

1.2 机械按压法

将真表皮分离后使用器械的弯曲部分对真皮施加压力并向组织块外侧反复挤压，将MVECs压出，收集细胞悬液离心并将目的细胞接种于培养皿中[9，12-16]。

通常认为该法不易发生成纤维细胞污染，但在提取正常组织或瘢痕疙瘩MVECs的实验操作中，我们发现此方法操作难度大且效率低下。可能是因为：①因组织细胞外基质较为紧密，单纯靠挤压组织中的血管内膜获取MVECs具有一定难度；②操作敏感度较高，不易保持恒定的按压力度，压力过大可能导致成纤维细胞污染，压力过小则难以提取真皮MVECs。因组织来源不同以及操作者个体差异，对力度的把握尚需多次尝试。

1.3 酶消化法

1.3.1 组织块酶消化法 应用酶制剂降解细胞外基质，使组织分散为单个细胞或细胞团块，通过滤器或滤网收集细胞悬液，离心后获取原代细胞进行培养。

目前分离真皮MVECs需使用的酶制剂包括：分离酶Ⅱ、胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶，脱氧核糖核酸酶Ⅰ等。其中分离酶Ⅱ可通过降解基底膜上的半桥粒对真表皮进行分离；胰蛋白酶可作用于赖氨酸或精氨酸残基处的羧基从而使细胞分离；胶原酶可水解结缔组织中的胶原蛋白；透明质酸酶可分解细胞外基质中的透明质酸；脱氧核糖核酸酶用于降解死细胞释放的DNA(DNA会促使细胞凝集，从而使细胞悬液过于黏稠)。通过联合使用上述酶制剂可将MVECs从组织中分离。

另外，部分实验室使用皮肤解离试剂盒获取MVECs原代细胞[17-19]。该试剂盒含有酶A、D、P，可将修剪后的人全层皮肤解离为单细胞悬液，后通过解离器将单细胞从细胞外基质中释放出来。

1.3.2 匀浆与酶联合法 该方法与组织块酶消化法类似，即先进行真表皮分离，后将真皮仔细剪碎呈匀浆状再进行酶消化。因组织与酶制剂的接触面积增大，消化更为充分[3]。

酶消化法操作简单，较为经济且所用酶制剂方便易得。但仍存在以下缺点：①纯化工作量大；只可获得混杂的皮肤组织来源细胞，无法直接获得目的细胞，需要配合大量的后期纯化工作；②干扰因素较多；消化时间长短、酶浓度高低等均可能对细胞的活力造成影响。因此，掌握酶联合制剂的用法以及消化时长是很有必要的。下面将列举部分酶联合制剂的使用方法(表1)。

表1 不同酶消化法的操作条件

通过对以上三种方法的分析并结合自身实操经验，我们认为组织贴壁法细胞爬出时间较长(2周左右)，其次爬出的细胞大多以梭形的成纤维细胞为主，鹅卵石样MVECs少见，且此法更常用于成纤维细胞的培养。同时，机械按压法成功概率较低，首先因细胞外基质的存在，仅靠外力很难使MVECs脱落下来，其次从脱落的絮状组织中爬出的多为成纤维细胞。因此我们更推荐酶消化法，此法操作简单，细胞外基质混杂较少，可以高效地使MVECs从组织中释放出来，具有良好应用前景。上述三种分离方法的优缺点见表2。

表2 不同MVECs分离方法比较

1.4 其他注意事项

1.4.1 组织样本处理 ①供体年龄不宜过大。衰老会影响血管生成能力，年轻供体的细胞增殖活力相对较强[28]。②组织应尽量新鲜。细胞活力关系着培养成功与否，因此原代提取应尽可能快速，以减少因环境变化引起的细胞损伤[29]。③组织样本严格处理，原代提取无菌操作。对于组织预处理中使用750 mL/L乙醇进行消毒的做法，目前存在争议，因750 mL/L乙醇会使组织脱水，处理过久可能会导致细胞的损伤。因此，样本不可在750 mL/L乙醇中浸泡过久，可短时间浸入750 mL/L乙醇后使用大量平衡盐溶液多次冲洗。④保存组织样本以及原代培养的培养基中需添加抗菌素。大部分文献提出通过青霉素、链霉素、庆大霉素和抗真菌剂(两性霉素B)等联合使用以抑制细菌或真菌的产生。

1.4.2 细胞提取操作细节 ①剔除脂肪等皮下组织，减少混杂细胞。②确保真表皮充分分离，其方式包括分离酶Ⅱ消化与表皮切除两种。我们结合自身实践认为，方法的选用需视皮肤状态而定。若以真皮增厚为主要表现的疾病如瘢痕疙瘩等，切除表皮用时短且可避免酶对细胞的损伤，细胞活性较好。对于正常皮肤或非真皮层增生疾病，切除难度较大，更推荐采用分离酶Ⅱ进行处理，消化时长不得超过15 h[9]。③修剪组织尽可能小，以便增加细胞提取率和酶作用效果(按压法除外，组织块过小会增加按压难度)。

1.4.3 细胞培养 ①在细胞爬出的过程中，可采取半换液的方式进行培养。②MVECs与成纤维细胞有明显区别。MVECs原代培养会形成呈同心圆状独立生长的细胞岛。文献中认为可通过换液时于显微镜下抽吸成纤维细胞将其去除[16]，但实际操作方面存在难度。

2 真皮MVECs的纯化

在MVECs的分离过程中会掺杂其他细胞，其中以成纤维细胞为主，可对MVECs生长产生一定的抑制作用[16]。因此，纯化是获得MVECs极为关键的一项步骤。

2.1 差异胰蛋白酶消化

基于不同细胞贴壁能力的差异，该方法通过控制胰蛋白酶消化时长，使贴壁能力弱的细胞悬浮，从而实现两种细胞的分离[11，30]。原代培养5～7 d后，存在生长优势的成纤维细胞与MVECs竞争生长[9]，此时为采用本方法去除成纤维细胞的最佳时机。

此方法经济且简单易行，但尚存在以下不足：①获得的细胞纯度不高。单纯依赖贴壁能力差异纯化MVECs，难免会存在其他细胞污染，无法达到研究所需的细胞纯度。②需要连续传代提高细胞纯度。TSOU等[8]对原代培养的硬皮病MVECs进行检测，发现在P7时许多细胞出现衰老迹象。因此对于原代细胞，P2～P6为开展实验的最佳选择。但在纯化过程中，连续的消化传代易错过细胞的最佳使用时机。③纯化效率受外界因素影响较大。酶浓度、消化时长、外界环境温度、细胞活力等均可影响纯化MVECs的效率。若酶浓度过高可对细胞造成损伤，消化时间不当可导致其他细胞混杂，且外界温度、细胞活力可影响酶消化细胞的时长。

2.2 流式细胞分选(fluorescence-activated cell sorter，FACS)

FACS采用荧光素标记不同分子[31]，通过精确的荧光过滤器和探测器，对混合细胞群中的细胞进行分类[32]。

FACS获得的细胞纯度高，可以同时分选存在多种表面标志的细胞且不影响细胞活力[33]，但也存在不足：①仪器价格昂贵；②仪器操作技术敏感性较高；③存在易发生交叉污染(其他细胞或细菌的污染)、喷嘴堵塞(细胞团块堵塞喷嘴)和试剂消耗量较大等情况[31]。

2.3 免疫磁珠分选(magnet-activated cell sorting，MACS)

多数文献采用MACS对MVECs进行纯化[3，9，13-14，16-17，19，34-35]。MACS基于抗原抗体特异性识别的原理，使用高度特异性单克隆抗体偶联的纳米级磁化微粒对目的细胞进行特异性的磁性标记，通过高强度磁场分选进而达到分离所需细胞的目的[31]。通常需要分别进行一次CD31正筛选(VECs的表面标志)[36]和CD45-负筛选(剔除CD31+的免疫细胞)以获得高纯度的MVECs[37]。

MACS分选的细胞纯度较高，设备简单，耗时短且效率高。小的磁珠一般不影响细胞的光散射特性以及荧光抗体对细胞的标记，因此无需解离磁珠便可直接进行后续实验。但此方法存在以下缺点：①成本较高。不能在普通试管中进行，需配备一次性分离柱。②一次只能进行一种细胞标志的分选，不可同时进行多种标志的筛选。③磁珠可能存在细胞毒性。研究表明，细胞与高浓度的磁珠长时间接触后，被吞噬的磁珠在胞内聚集，影响细胞的正常生理功能[38]。此外，胞内磁珠刺激细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，高ROS水平可氧化细胞膜结构、破坏DNA并影响基因转录，导致细胞生理功能下降甚至细胞死亡[39-40]。

在MACS中，需注意：①内皮细胞与免疫磁珠的比例为关键参数[16]。因成纤维细胞可吞噬磁珠[38]，若磁珠数量过少，会导致部分MVECs丢失；若磁珠数量过高，会阻碍纯化后期MVECs的生长，导致成纤维细胞占比增加，因此需要正确计算磁珠的需要量。所需磁珠数目可根据培养中成纤维细胞的比例进行计算。若出现较多的MVECs群，可考虑磁珠与细胞数目之比为1∶1；若成纤维细胞更多，可调整磁珠数量与细胞比例为1∶2～1∶4。②可在磁珠分选前进行两次差异分选，提前筛去部分成纤维细胞，以提高MVECs纯度[16]。上述三种纯化方法的优缺点见表3。

表3 VECs纯化方法优缺点

细胞纯化是完成分离后的一个重要环节。纯化方法的选择受分离方式的影响，若选择酶消化法进行分离，在纯化环节可选择免疫磁珠或FACS。因为分离中存在大量真皮来源的其他细胞干扰，单纯通过差异胰蛋白酶消化法难以达到目标纯度。MACS也可用作FACS前的预分离，以减少FACS所用时间[3]。若采用机械按压法进行分离，纯化方法可选择差异胰蛋白酶消化法，MACS为备选方案[9]。

3 VECs的鉴定

3.1 形态学

3.1.1 光学显微镜观察 60 h内可见贴壁细胞数量持续增加，细胞多呈短梭形。3～4 d细胞形态拉长呈“纺锤形”。6～10 d细胞密集，呈典型单层“铺路石样”[34，41]。

3.1.2 电镜观察 MVECs细胞内可见Weibel-Palade小体[34，42]，胞质内富含线粒体、粗面内质网、发育完好的高尔基复合体，细胞表面存在锯齿状桥粒。

3.2 细胞标志

3.2.1 血小板-内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31) CD31是MVECs上表达最丰富的跨膜糖蛋白，与白细胞运输、机械力传导和血管通透性有关[2]。研究发现CD31抗体可抑制小鼠肿瘤内部的血管生成，可见CD31对血管的形成必不可少。CD31主要分布于细胞连接深处，但其分子定位处于动态变化之中，其在胞膜上的分布不仅与细胞骨架重排有关，同时受细胞膜微域的影响。CD31是最敏感的内皮标记物[43]，常被用于血管定位或鉴定。

3.2.2 von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF) vWF是由内皮细胞产生的一种多聚糖蛋白，在止血、血管壁稳态和损伤后修复中扮演着重要角色。当内皮损伤或受到刺激时，vWF从内皮细胞中释放，沉积于血管的受损部位，导致局部血小板聚集[44]。vWF主要储存于胞质的Weibel-Palade小体中。自从1972年HOYER等在VECs中发现vWF后，因其具有高度的敏感度和良好的特异度，常被用作MVECs标志物[45]。

3.2.3 血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin，CD144) VE-Cadherin是内皮细胞黏附连接的主要蛋白，不仅维持着血管结构和功能的完整性，还调控着内皮细胞的发育与生长。其主要分布在内皮之间的黏附连接处[46]。VE-Cadherin仅在内皮细胞上表达，因此是内皮细胞最特异的标志物之一[47]。

3.2.4 CD34 CD34是一种细胞表面跨膜糖蛋白[48]，在细胞间黏附、调节细胞增殖和分化中发挥重要作用[37]。CD34起初被视为造血干细胞的标志，随着研究的深入发现其可表达于早期VECs，其主要见于外周循环的血管腔内膜和血管出芽端的细胞外膜上[49]，少部分存在于未参与循环的小血管内膜，可作为内皮标记物之一[50]。但在体外培养中，因细胞接触以及外部环境影响，MVECs可能丢失这一标志物[8]。

3.2.5 内皮糖蛋白(CD105) CD105是一种同源二聚体跨膜糖蛋白，对血管生成至关重要，例如CD105基因敲除小鼠，因血管生成缺陷在子宫内便死亡[34，51]。CD105在增殖活跃的内皮细胞上高度表达，可作为MVEVs的一种标志物[52]。

3.2.6 血管紧张素转换酶(CD143) CD143作为一种胞外糖蛋白，存在于内皮细胞的管腔面。与正常内皮细胞相比，出芽VECs中CD143表达显著下调[53]。因此CD143低表达可作为新血管形成过程中内皮细胞的标志物[54-55]。

上述六种分子均为VECs标记物，但在相关文献中，多采用CD31与vWF进行MVECs鉴定。若在纯化方法中，选择免疫磁珠或流式细胞术进行表面标志物的分选，可忽略鉴定部分直接进行后续操作。

4 结束语

不同组织来源的VECs之间存在差异。因此要反映疾病特征，应获取相应部位的MVECs进行研究。本文通过对原代MVECs的分离、纯化与鉴定方法的分析，希望寻找一种能够快速获得高质量、高纯度的原始病理状态下MVECs的方法，从而明确不同疾病下的细胞功能，增进对疾病发生、发展进程的了解与认识，为疾病的治疗和预防提供更加直观的新思路和新见解。