微RNA-204-5p、蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1在新生儿肺炎血清中的表达

白彦红，陈华，谢影，王少君

作者单位：张家口市妇幼保健院新生儿科，河北 张家口 075000

新生儿肺发育不完善，易受细菌和病毒感染而引发肺炎，近年来随着技术水平的进步，新生儿肺炎（NP）发病率和病死率都有所降低，但NP 仍旧是全球范围内影响新生儿健康的主要原因之一，尤其是在发展中国家［1-2］。肺炎经常表现为涉及多个器官系统的全身性恶化，新生儿常见的非感染性呼吸道并发症常与肺炎并存并加重肺炎，若不能得到及时的针对性治疗，可能引起病儿呼吸衰竭甚至死亡［3-4］。而及早评估病情对确认最佳治疗方案至关重要。血清学检查在评估NP 病情上的应用逐渐受到认可［5-6］，然而缺乏有效的预后预测标志物。研究显示，微RNA-204-5p（miR-204-5p）在非小细胞肺癌组织高表达，随病情加重而显著降低［7］；蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1（ZEB1）是一种锌指转录因子，通过调节上皮钙黏素和波形蛋白来诱导上皮-间质转化［8］。另外，ZEB1是miR-204的直接靶标，在肺支气管上皮细胞中miR-204/ZEB1 轴能够促进EMT 和恶性转化［9］。然而关于miR-204-5p、ZEB1 在NP 病儿血清中的表达情况及其在病情评估及预后预测中的价值目前尚无统一定论。本研究检测NP 病儿血清中miR-204-5p 与ZEB1 的表达水平并分析其与病情严重程度的关系及预测NP 病儿预后的价值，期望为NP 病情评估及预后预测提供有价值的临床生物学指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2021 年10 月至2022 年5 月张家口市妇幼保健院收治的NP 病儿80 例为NP 组，其中男42 例，女38 例；顺产50 例，剖宫产30 例；日龄范围为4～28 d，日龄（16.50±6.38）d；胎龄范围为35～40周。依据临床肺部感染评分（CPIS）评分（总分12分）对NP 病儿进行分组，分为轻症组（49 例，＜6 分）和重症组（31 例，≥6 分）；根据病儿预后情况分为预后良好（58 例）和预后不良（22 例）两个亚组。纳入标准：（1）根据《实用新生儿学（第4 版）》中NP 的诊断标准［10］，结合病儿临床表现、胸部X线和实验室检查确诊为NP；（2）出生时间≤28 d；（3）监护人知晓研究过程并自愿配合。排除标准：（1）先天性支气管疾病；（2）其他出生疾病如新生儿脑性疾病、全身炎症、胎粪吸入综合征及伴有出生窒息等；（3）伴其他影响血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）及C 反应蛋白（CRP）水平的疾病。另选取同期张家口市妇幼保健院出生的健康新生儿80 例作为对照组，其中男45 例、女35 例，顺产55 例、剖宫产25 例，日龄范围为3～28 d，日龄（16.51±6.89）d，胎龄范围为36～42 周，两组的性别、年龄、生产方式和胎龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 检测方法实时荧光定量PCR 法检测血清miR-204-5p 相对表达水平：取病儿空腹静脉血3mL，离心后取上清液，分为两份，置于无菌抗凝管中，保存待测。取其中一份，室温解冻，依据Trizol试剂（Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher）所述操作步骤提取总RNA，并测定其浓度和纯度，逆转录试剂盒（Takara 提供）逆转录合成cDNA，采用ABI 7500型qRT-PCR 仪（ABI 公司，美国）检测血清中miR-204-5p相对表达水平，以U6为内参。各样品重复3 次以减小实验误差，2-ΔΔCt法（Ct 表示循环阈值）计算目的基因miR-204-5p的相对表达量。

取另一份血清用于ZEB1、CK、CK-MB及CRP的检测，ZEB1、CRP测定使用酶联免疫吸附法（ELISA）法，试剂盒购自日本SHINO-TEST 公司；CK、CK-MB测定采用速率法，全自动生化分析仪和检测用试剂盒均由美国GEM公司提供，依据试剂盒说明操作。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0 进行数据处理，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；计量资料各组血清中miR-204-5p、ZEB1等的表达水平以±s表示，两组间比较采用t检验，采用Pearson 法分析NP病儿血清miR-204-5p、ZEB1水平及其与临床指标的相关性；应用受试者操作特征（ROC）曲线分析miR-204-5p、ZEB1 及二者联合预测NP 不良预后的价值。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NP 组与对照组临床指标的比较NP 组血清miR-204-5p 水平、血氧饱和度显著低于对照组，血清ZEB1、CK-MB 及CRP 水平显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 新生儿肺炎（NP）组与对照组临床指标比较/± s

表1 新生儿肺炎（NP）组与对照组临床指标比较/± s

注：miR-204-5p为微RNA-204-5p，ZEB1为蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1，CK-MB为肌酸激酶同工酶，CRP为C反应蛋白。

组别对照组NP组t值P值CRP/（mg/L）3.31±0.71 18.09±4.29 30.40＜0.001例数80 80 miR-204-5p 1.01±0.21 0.47±0.16 18.30＜0.001 ZEB1/（ng/L）2.15±0.36 4.76±0.71 29.32＜0.001血氧饱和度/%95.32±6.74 83.99±6.15 11.11＜0.001 CK-MB/（U/L）23.22±9.64 46.25±12.52 13.04＜0.001

2.2 不同病情NP病儿临床指标比较重症组血清miR-204-5p 水平、血氧饱和度显著低于轻症组，血清ZEB1、CK-MB 及CRP 水平显著高于轻症组（P＜0.05）。见表2。

表2 不同病情新生儿肺炎（NP）临床指标比较/± s

表2 不同病情新生儿肺炎（NP）临床指标比较/± s

注：miR-204-5p为微RNA-204-5p，ZEB1为蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1，CK-MB为肌酸激酶同工酶，CRP为C反应蛋白。

组别轻症组重症组t值P值CRP/（mg/L）11.21±3.22 28.96±6.59 16.10＜0.001例数49 31 miR-204-5p 0.51±0.14 0.41±0.11 3.37 0.001 ZEB1/（ng/L）4.06±0.17 5.87±0.23 40.39＜0.001血氧饱和度/%87.52±6.34 78.41±5.85 6.45＜0.001 CK-MB/（U/L）35.28±9.28 63.59±10.81 12.46＜0.001

2.3 miR-204-5p、ZEB1 水平之间及二者与临床指标的相关性血清miR-204-5p 水平与CPIS 评分、CK-MB 及CRP 水平呈负相关（r=-0.33、-0.30、-0.40，P＜0.05），与血氧饱和度呈正相关（r=0.41，P＜0.05）；血清ZEB1 水平与CPIS 评分、CK-MB 及CRP水平呈正相关（r=0.28、0.37、0.44，P＜0.05），与血氧饱和度呈负相关（r=-0.36，P＜0.05）。血清miR-204-5p水平与ZEB1水平呈负相关（r=-0.56，P＜0.05）。

2.4 不同预后NP病儿临床指标比较预后不良组血清miR-204-5p 水平、血氧饱和度低于预后良好组（P＜0.05），血清ZEB1、CK、CK-MB 及CRP 水平均显著高于预后良好组（P＜0.05）。见表3。

表3 不同预后新生儿肺炎（NP）临床指标比较/± s

表3 不同预后新生儿肺炎（NP）临床指标比较/± s

注：miR-204-5p为微RNA-204-5p，ZEB1为蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白1，CK-MB为肌酸激酶同工酶，CRP为C反应蛋白。

组别预后良好预后不良t值P值CRP/（mg/L）11.37±2.35 35.81±4.83 30.39＜0.001例数58 22 miR-204-5p 0.52±0.14 0.35±0.11 5.12＜0.001 ZEB1/（ng/L）4.02±1.26 6.71±1.61 7.88＜0.001血氧饱和度/%87.63±5.74 74.39±7.23 8.56＜0.001 CK-MB/（U/L）34.00±8.56 78.54±21.47 13.35＜0.001

2.5 miR-204-5p、ZEB1 预测NP 不良预后的价值miR-204-5p 对NP 不良预后预测的AUC 为0.89，截断值为0.47，其灵敏度、特异度分别为95.12%、72.41%；ZEB1 对NP 不良预后预测的AUC 为0.92，截断值为5.16，其灵敏度、特异度分别为87.80%、86.21%；二者联合对NP 不良预后预测的AUC 为0.99，明显高于二者单独诊断，其灵敏度、特异度分别为97.56%、94.83%。

3 讨论

与儿童和成人相比，新生儿先天免疫系统未成熟，肺等呼吸系统发育不健全，抵御肺部感染的能力有限［11］。一般轻症NP 症状轻、治疗有效、预后良好，而重症NP 起病急、不易治疗、并发症多，预后较差［12］，因此寻找NP 病情评估及预后预测标志物对提升病儿预后非常重要。

真核生物体内存在多种miRNA，是一类高度保守性的长度约13-27 个核苷酸非编码RNA，可以与下游靶基因的3'-非翻译区结合，抑制翻译或降解mRNA，进而对疾病进展起到调控作用［13］。相关研究表明，miR-204-5p 与肺部疾病如非小细胞肺癌关系密切，引入miR-204-5p 及其靶标对于肺癌的治疗及预后改善具有积极作用［14］。而降低miR-204-5p会逆转上皮细胞的上皮-间质转化、增殖和迁移过程［15］。在本研究中，NP病儿血清miR-204-5p水平显著低于健康新生儿，与Luo 等［9］研究结果相似，表明miR-204-5p 与NP 的发生有关。重症组血清miR-204-5p 水平显著低于轻症组，且血清miR-204-5p 水平与CPIS 评分、CK-MB 及CRP 水平呈负相关（r=-0.33、-0.30、-0.40），与血氧饱和度呈正相关（r=0.41），提示miR-204-5p 水平与NP 病情严重程度密切相关，miR-204-5p 可能参与了NP 病情的发生发展。机体缺氧时心肌细胞受损严重，心肌损害是导致NP 病儿死亡的重要原因之一，NP 病儿均有不同程度的心肌损伤，且NP 病儿心肌损伤随病情加重而加重［16-17］；而CPIS评分是评估NP病儿临床感染程度的指标。结合本研究相关性分析结果，推测miR-204-5p可能参与NP病儿肺部感染致心肌损害进程，然而其机制不清楚。本研究还显示，预后不良组血清miR-204-5p 水平低于预后良好组，miR-204-5p 对NP不良预后预测的AUC为0.89，灵敏度较高但特异度不高，对NP不良预后具有一定的预测价值。

ZEB1参与多种肺部疾病如肺癌［18］、肺纤维化［19］等进展。有证据表明，ZEB1可介导人肺泡上皮Ⅱ型细胞的EMT，并向潜在成纤维细胞发出信号，促进肺纤维化的发展［10］。在本研究中，NP 病儿血清ZEB1水平高于健康新生儿，提示ZEB1与NP的发生有关，且病情越严重ZEB1 水平越高，说明NP 病儿的病情进展过程中可能有ZEB1 的参与。而血清ZEB1 水平与CPIS 评分、CK-MB 及CRP 水平呈正相关（r=0.28、0.37、0.44），与血氧饱和度呈负相关（r=-0.36），说明ZEB1 对NP 病情起负向调控作用。另外，NP 病儿血清miR-204-5p 水平与ZEB1 水平呈负相关，这与网站预测的miR-204-5p 与ZEB1 存在靶向关系相一致，推测miR-204-5p 可能通过调节ZEB1 共同参与NP 病情调节。进一步分析显示，预后不良组血清ZEB1 水平高于预后良好组，ZEB1 对NP 不良预后预测也具有一定价值，而miR-204-5p、ZEB1 联合对NP 不良预后预测的AUC 为0.99，明显高于二者单独诊断，其灵敏度、特异度分别为97.56%、94.83%，说明二者联合对NP 不良预后具有较高的预测价值，有望成为预测NP 预后评估的血清指标。

综上所述，miR-204-5p 在NP 病儿血清中低表达，ZEB1 在NP 病儿血清中高表达，二者均与NP 病情严重程度有关，miR-204-5p、ZEB1 联合对NP 不良预后具有较高的预测价值。但本研究纳入样本量相对较少，关于miR-204-5p 与ZEB1 参与NP 病情进展的具体机制仍需深入探索。