维生素E聚乙二醇琥珀酸酯乳化α-生育酚琥珀酸酯纳米乳的制备及体外抗肿瘤细胞活性评价

齐雪静，曹辉，赵宇，张引兰

作者单位：1南京市第二医院、南京中医药大学附属南京医院药学部，江苏 南京 210003；2齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161003

α-TOS 是天然维生素E（vitamin E， VE）的一种酯化衍生物（结构如图1）。近年来越来越多的文献报道α-TOS 可以通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡，在体外对小鼠黑色素瘤［1］、乳腺癌［2］、前列腺癌［3］、淋巴癌［4］、结肠癌［5］等细胞株均具有较强的抑制作用。此外，相对于传统药物α-TOS 具有较好的选择性，能选择性地杀灭肿瘤细胞，对正常细胞没有毒副作用［6-7］。这种高效低毒的抗肿瘤特性使其成为理想的线粒体靶向抗肿瘤候选药物。然而由于α-TOS 具有水溶性差、易被人体内的酯酶水解等缺点，从而限制了其临床应用。

图1 α-TOS的结构

为了克服上述问题，将纳米给药系统应用于抗肿瘤领域的技术应运而生。纳米给药系统具有结构稳定、毒性小、生物相容性良好、提高药物的生物利用度等优点。目前α-TOS 的纳米制剂包括纳米粒、纳米乳、脂质体、纳米囊泡等，这些制剂不仅改善了α-TOS的溶解性，同时提高了药物的靶向性，相对于传统制剂有更突出的优势，但目前临床上还未有上市制剂。然而纳米制剂也存在辅料用量大、载药量低、材料自身毒性等缺点。因此选择合适的辅料具有重要意义。维生素E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）是一种聚乙二醇（PEG）维生素E 琥珀酸盐的衍生物，具有两亲性质［8］，HLB 值为13.2，水溶性较好［9］，广泛用作乳化剂、增溶剂、药物传递载体及增塑剂［10-13］，旨在提高药物的生物利用度［14］、包封率［15］、细胞毒性和延长药物半衰期［16］。此外TPGS对P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）具有抑制作用，可以逆转肿瘤细胞的多药耐药［17］。因此TPGS 在抗肿瘤药物传递系统应用较为广泛。本研究自2022 年1—4 月基于α-TOS 的局限性设计开发了α-生育酚琥珀酸酯纳米乳（T-NE），根据前期的研究成果选择了合适的处方，并通过伪三元相图对处方进行了优化；然后通过外观、类型、粒径、载药量、透射电镜、多分散系数、放置稳定性等方法系统地表征了T-NE；最后通过体外抗肿瘤细胞活性实验证明纳米乳增加了α-TOS的药效。

1 材料和方法

1.1 仪器AEU-210 型分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA124S-CW），恒温加热磁力搅拌器（上海晓霄实验仪器设备有限公司，SH-3），KQ3200E 医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），激光粒径分析仪（英国Malvern 公司，Zetasizer 3000HS），台式低速大容量离心机（南京晓晓仪器设备有限公司，湘仪L-550），Agilent1260 Infinity 液相色谱仪（美国安捷伦公司）， MCO-15AC 二氧化碳培养箱（三洋电器股份有限公司），LDZX-50A2780型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），倒置生物显微镜（北京佳源兴业科技有限公司，XDS-1B），酶标仪（Tecan 集团奥地利有限公司，Infinite 200 PRO），Hitachi-HT7700透射电镜（上海沪西分析仪器厂有限公司），一次性无菌U 型底96 孔板（浙江拱东医用塑厂）。

1.2 材料α-TOS（迈瑞达，批号M097147），TPGS（迈瑞达，批号M057777），维生素E（VE）（迈瑞达，批号M159328），PEG 400（迈瑞达，批号M056425），RPMI1640细胞培养液（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号A1049101），唑溴盐（MTT）（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号M6494），胎牛血清（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号16140089），0.25 %含EDTA 胰酶（Gibco公司，批号R001100），二甲基亚砜（DMSO）（赛默飞世尔生物化学制品有限公司，批号20688），无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，色谱纯），青霉素-链霉素（100万单位/瓶）（Gibco 公司，批号15140148），高效液相用试剂均为分析纯。

1.3 细胞人乳腺癌细胞系MCF-7 和人卵巢癌细胞系A2780，由南京市第二医院临床科研中心赠送。

2 方法

2.1 空白纳米乳处方初步筛选及优化纳米乳处方设计最重要的一步是选择合适的组分以及确定各组分比例，本研究通过文献阅读及前期研究经验最终确定TPGS 做表面活性剂，PEG400 做助表面活性剂、VE 做油相。采用水滴定法绘制伪三元相图，确定纳米乳区的范围，以纳米乳区域的大小为指标找出纳米乳的最佳处方组分比例。

伪三元相图优化处方：室温下，将表面活性剂与助表面活性剂按一定的比例混合，作为混合表面活性剂（Smix），其质量比记为Km，精密称取油相，使其与混合表面活性剂按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1（w/w）的比例混合，磁力搅拌混匀后逐滴加入水，当水滴加到某一点时，体系的黏度突然变小，形成澄清、透明有蓝色乳光的纳米乳，记录此时滴定的蒸馏水的量，计算形成纳米乳时临界点各组分的质量，计算出其百分含量。以Oil、Smix、Water 分别作为相图的3 个顶点，应用Origin 8.5 软件绘制伪三元相图，图中只标出了纳米乳区（NE）。实验中又考察了空白纳米乳中VE/TPGS=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（w/w）时以澄清度为指标纳米乳的形成情况，确定油相与乳化剂的比例。

2.3 制剂学性质评价

2.3.1纳米乳类型鉴别 采用染色法鉴别纳米乳的类型，取相同体积的T-NE 两份，同时分别滴加适量甲基红及亚甲基蓝染料溶液，静止放置，观察两种染料（红色和蓝色）在纳米乳液中扩散速度的快慢以及外观的变化。甲基红染料为油溶性染料，易在油相中扩散；亚甲基蓝染料为水溶性染料，易在水溶液中扩散。若蓝色的扩散速度大于红色的扩散速度，则为O/W 型纳米乳，反之则为W/O 型纳米乳。

2.3.2纳米乳类型的形态学考察 取新鲜制备的

T-NE 稀释适量倍数，滴置于覆有支撑膜的铜网上，固定2～3 min 后用滤纸小片从铜网边缘吸干多余的液体，用1%的磷钨酸液染色2 ～ 3 min，吸干多余染液，自然干燥，置于透射电镜下观察其形态。

2.3.3粒径分布及Zeta 电位测定 粒径是衡量纳米乳形成与否的绝对标准，也是区分普通乳剂、亚纳米乳和纳米乳的重要指标，粒径的分布是评价纳米乳稳定性的最重要性质之一。

取新制备T-NE 溶液，用适量蒸馏水稀释后，用Zetasizer ZS90 激光粒径分析仪测定其粒径、粒径分布及Zeta电位。以上实验重复3次。

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2.3.4含量测定 色谱柱：DiamonsilTMC18柱（200mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：纯甲醇，磷酸调pH 3.1～3.9；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；α-TOS 检测波长：284 nm；进样量：10 μL。α-TOS 的峰面积和浓度满足线性方程A=2.222 9C-4.702 7（r=0.999 9），在5.00 ～ 250 mg/L浓度范围内，线性关系良好。

样品溶液配制：吸取50 μL T-NE 于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，超声破乳，5 000 r/min 离心5 min，取上清液即得样品溶液，4 ℃冰箱保存备用。

取新鲜制备的3 份T-NE，按“样品溶液配制”项下方法处理后，在上述色谱条件基础上采用HPLC法测定T-NE制剂中α-TOS的含量。

2.3.5稳定性考察

2.3.5.1温度 取新鲜制备的T-NE 密封于西林瓶中，分别在4、25、37 ℃不同温度下放置，并于第5、10、20、40、60 、90 d 后的固定时间点取样，并记录T-NE的外观和药物含量变化。

2.3.5.2长期稳定性 取新鲜制备的T-NE 密封于西林瓶中，于常温下放置9 个月，分别在3、6、9 个月后的固定时间点取样，并记录T-NE的外观和药物含量变化。

2.4 细胞活力实验（MTT）

2.4.1细胞培养 将人乳腺癌细胞MCF-7、人卵巢癌细胞A2780 分别置于RPMI 1640 培养液（含10%新生胎牛血清FBS，青霉素、链霉素各100 U/mL）的75 cm3培养瓶中，在37 ℃、5%二氧化碳，以及饱和湿度条件下培养。

2.4.2MTT 实验 分别取对数期MCF-7 和A2780用胰酶进行消化形成细胞悬液，进行细胞计数。用RPMI 1640 调整细胞悬液浓度为2.5×107个/升，将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔接种100 μL。实验设四组，分别将T-NE 和游离α-TOS（DMSO＜0.25%）溶液用RPMI 1640 稀释成2、5、10、15、20 μmol/L 浓度作为制剂测试实验组。配制α-TOS 在15 μmol/L和20 μmol/L 浓度下的T-NE 所对应空白纳米乳溶液，并配制DMSO 的RPMI 1640，考察实验所用最大浓度DMSO 对细胞活力是否产生影响。给药的同时，建立细胞对照组（未加药物处理）和阴性培养液空白对照组，每组6 个样本。加药后继续培养48 h，将板中的培养液弃去，每孔中加MTT 溶液（5 g/L）20 μL，震荡混匀后继续培养4 h，弃上清，每孔加入DMSO100 μL 震荡5 min 溶解结晶后，在全自动酶标仪上490 nm 处测定各孔的光密度值（OD），计算存活率。

存活率的计算公式：存活率（100%）=［（实验组的OD 值-空白的OD 值）/（对照组的OD 值-空白的OD值）］×100%。

2.5 统计学方法本研究采用SPSS 25.0 统计软件（美国IBM 公司）处理，计量资料采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 伪三元相图优化处方由图2 可知，随着Km增大，纳米乳区域逐渐增大，Km=3∶1 与Km=2∶1 时纳米乳区域接近，Km=3∶1 时形成的纳米乳黏度较大且制备过程中易形成凝胶，考虑到尽量减少表面活性剂用量的要求，选取最优Km 为2∶1。且当VE/TPGS=1∶2 时制得的纳米乳较为均一透明，放置稳定性较好。以载药量和澄清度为指标，结果得到纳米乳处方最优处方：α-TOS、VE、TPGS、PEG 400质量比为1∶1∶2∶1、蒸馏水2 mL。

图2 纳米乳的伪三元相图

3.2 T-NE 的制备采用乳化蒸发法制备出均一透明伴有蓝乳光的T-NE。

3.3 制剂学性质评价

3.3.1纳米乳类型的确定 T-NE 样品染色发现，亚甲基蓝扩散的速度明显快于苏丹红，呈现均匀的深蓝色，而苏丹红染料完全悬浮于样品溶液上不扩散，表明所制备的T-NE为O/W型。

3.3.2形态学考察 结果如图3 所示，表明制得的T-NE外观形态呈类球型，大小均匀，表面光滑圆整，粒子间无粘连。

图3 T-NE电镜图

3.3.3粒径大小、分布和Zeta 电位 在最优处方工艺条件下，平行3 次制备T-NE，粒径和Zeta 电位的测定结果见图4 和图5。纳米乳平均粒径为（258.8±3.48）nm，PDI 为0.136±0.03，平均Zeta 电位值为（-27.0±0.46）mV。表明新鲜制备的T-NE 分散性良好，粒径较小且分布均一，稳定性较好，不易聚集。

图4 T-NE的粒径分布图

图5 T-NE的Zeta电位分布图

3.3.4含量测定 新鲜制备的T-NE 的平均载药量为（20.15±1.91）g/L，制得的纳米乳载药量较高。

3.3.5稳定性考察 由表1 可知，T-NE 在4 ℃和25 ℃条件下稳定性良好，90 d 外观依旧保持均匀泛蓝色乳光，且药物含量未发生明显变化。37 ℃条件下放置40 d 有絮结出现，可能和细菌滋生有关，在60 d 和90 d 出现破乳，部分α-TOS 析出。上述结果表明，T-NE 放置在4 ℃和25 ℃条件下保存较稳定。T-NE 在常温下放置3、6、9 个月含量分别为（20.08±0.80）、（20.01±0.92）、（19.94±2.22）g/L，三组差异无统计学意义（P＞0.05），且外观保持淡蓝色均一乳状液体，表明T-NE有较好的长期贮存稳定性。

表1 温度对T-NE稳定性的影响（n=3，± s）

表1 温度对T-NE稳定性的影响（n=3，± s）

时间5 d 20 d 40 d 60 d 90 d F值P值4 ℃25 ℃37 ℃外观均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光含量/（g/L）20.14±2.82 19.98±1.78 19.89±2.57 19.98±0.42 20.07±1.80 0.65 0.637外观均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光含量/（g/L）20.09±1.25 19.74±2.31 19.80±1.56 20.09±2.14 19.95±0.75 2.72 0.091外观均匀、蓝色乳光均匀、蓝色乳光有絮结有絮结、沉淀有絮结、沉淀含量/（g/L）20.10±1.61 20.02±0.94 19.85±1.89 15.58±1.92 15.48±1.43 468.80＜0.001 F值0.04 2.16 0.12 581.80 893.60 P值0.956 0.197 0.891＜0.001＜0.001

3.4 MTT实验为了验证T-NE对MCF-7和A2780细胞活力的作用以及空白纳米乳对α-TOS毒性作用的影响，进行了MTT实验。结果见表2，3。

表2 不同药物对MCF-7细胞作用48 h后细胞存活率（n=6，± s）

表2 不同药物对MCF-7细胞作用48 h后细胞存活率（n=6，± s）

注：-表示不需要检测。MCF-7为人乳腺癌细胞，DMSO为二甲基亚砜，T-NE为α-生育酚琥珀酸酯纳米乳。

浓度5 μmol/L 10 μmol/L 15 μmol/L 20 μmol/L P值0.568 0.001＜0.001＜0.001空白纳米乳DMSO------87.32±4.50 92.99±4.57 T-NE 101.96±10.59 78.88±5.30 65.62±2.35 31.17±8.91游离α-TOS 104.94±6.40 97.68±8.76 87.50±7.49 76.90±11.82

表3 不同药物对A2780细胞作用48 h后细胞存活率（n=6，± s）

表3 不同药物对A2780细胞作用48 h后细胞存活率（n=6，± s）

注：-表示不需要检测。A2780 为人卵巢癌细胞，DMSO 为二甲基亚砜，T-NE为α-生育酚琥珀酸酯纳米乳。

空白纳米乳---浓度2 μmol/L 5 μmol/L 10μmol/L 15μmol/L DMSO---P值0.028 0.004 0.011＜0.001 87.61±3.52 97.15±4.24 T-NE 76.83±4.52 73.23±2.69 45.52±4.01 12.29±1.83游离 α-TOS 83.03±2.97 79.71±2.79 54.95±5.41 21.60±2.86

以MCF-7 细胞为模型，T-NE 的IC50值为16.68 μmol/L，在20 μmol/L 浓度下α-TOS游离药物组细胞存活率仍为76.90%；以A2780 细胞为模型，T-NE 组较游离药物组细胞存活率明显下降，IC50值更小，是游离α-TOSIC50值（9.54 μmol/L）的 0.79 倍，且空白纳米乳作用于上述两种细胞48 h 后，细胞的存活率均大于80%，同时实验所用浓度的DMSO 不会对细胞产生干扰。可以认为将α-TOS载入纳米乳中能明显提高药物抑制肿瘤细胞增殖的能力，且空白纳米乳基本无毒性作用，由此可见本实验所制备的T-NE作为一种新剂型的药物传递系统，能够较好地发挥α-TOS的抗肿瘤作用。

4 讨论

纳米乳常规制备方法主要有高压乳匀法、微乳法、乳化蒸发法、溶剂乳化法、薄膜-超声分散法等。本实验结合近年来国内外大量的文献报道，通过对各种制备方法进行分析比较并结合本实验室对纳米制剂的研究经验，最终选定了乳化蒸发法制备纳米乳。乳化蒸发法与其他方法相比操作简单、条件可控。由于α-TOS对光、热敏感，所以在滴加油相的操作过程中应控制温度不高于40 ℃且制备成功后避光保存，确保得到稳定且外观均一澄清泛蓝光的纳米乳。

Gaonkar 等［18］用TPGS 做乳化剂得到的纳米乳均有很高的载药量和包封率。鉴于TPGS 优良的乳化性能和较高的安全性，结合前期研究［14］将乳化剂聚氧乙烯蓖麻油更换为TPGS，旨在规避其不良反应如急性超敏反应、神经毒性等［19］，同时提高α-TOS的溶解度和抗肿瘤效果。将油相油酸乙酯替换为VE，制备了新型的T-NE，并考察了Km 值对乳化区域的影响，结果表明用VE/TPGS/ PEG400=1∶2∶1 和水系统制备的纳米乳体系性状良好，为带蓝光的透明均一溶液，粒径小且分布均匀，载药量高达（20.15±1.91）g/L，且在4 ℃和25 ℃条件下保存90 d 依旧稳定不分层，且适合室温长期贮存。

前期预实验研究中MCF-7 和A2780 细胞系对α-TOS 相对比较敏感，因此MTT 实验中将其作为细胞模型。结果表明将α-TOS 包载于纳米乳中，能够较好地发挥药物抗肿瘤活性作用，最大浓度的空白纳米乳处理后的细胞与阴性对照组相比没有显著差别。因此，空白纳米乳在实验中仅作为传递α-TOS 的载体，实验中所观察到的细胞毒性作用均由药物本身引起，同时表明实验浓度下天然的化合物辅料TPGS、VE 和PEG400 无细胞毒性作用，具有较好的安全性。

本实验成功制备了T-NE，改善了α-TOS 的不足，并通过外观、粒径、类型、稳定性等对其进行了系统的表征；体外肿瘤细胞活性评价初步验证明纳米乳可以增强α-TOS 对肿瘤细胞的抑制作用，且理化性质满足静脉注射剂的要求，为α-TOS 的制剂开发和深入研究提供了参考。后期课题组会进一步考察其体外释放试验、流式细胞术、荷瘤鼠以及安全性试验等，以期为其用于临床研究提供理论基础。