液相色谱-串联质谱法测定蓝芩口服液中16种化学成分的含量

吴凡，陈辉，，张杞柳，汤道权

作者单位：1徐州医科大学，江苏 徐州 221004；2徐州市药品监督检验中心，江苏 徐州 221002

蓝芩口服液主要由板蓝根、黄芩、栀子、黄柏、胖大海五味中药经一定的加工工艺制备而成。具有清热解毒、利咽消肿等功效，目前已在临床上被广泛应用于治疗上呼吸道感染等多种疾病，又多用于儿童用药，因此，对其进行全面的质量控制至关重要。由于蓝芩口服液由多种中药组成，中药又具有多成分多靶点的特点，因此，蓝芩口服液的疗效是多种成分共同作用的结果，基于中药的“君臣佐使”理论［1］，中药的每种成分都可能发挥着至关重要的作用，因此，较大范围地检测蓝芩口服液的活性成分对蓝芩口服液的质量控制具有重要意义。但其现行质量标准仅对栀子中的栀子苷进行质量控制，不能科学、全面地反应蓝芩口服液的整体质量。栗焕焕等［2］利用高效液相色谱法（HPLC）建立了盐酸小檗碱、木兰花碱等12 种成分的含量测定方法。陈辉等［3］利用双波长高效液相色谱法建立了绿原酸、栀子苷等5 种成分的含量测定方法。孙燕等［4］利用HPLC 波长切换法建立了（R，S）-告依春、黄芩苷等4种成分的含量测定方法。但活性成分中有的紫外吸收弱，HPLC 方法无法对这些成分准确定量。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）相较于HPLC 方法灵敏度更高，且没有紫外吸收对化合物也能准确定量。也有研究人员和笔者所在团队曾利用LCMS/MS 法对蓝芩口服液中的几种成分进行定量分析［5-7］，但分析成分较少，无法全面反映整体质量。

板蓝根中的鸟苷、腺苷、胞苷、表告依春具有抗炎、抗病毒的药理作用［8］，异牡荆苷具有止咳作用。黄芩中以黄酮类化合物为主的汉黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩素和黄芩素具有抗氧化、抗炎、抗溃疡等药理作用［9-10］。栀子中的环烯醚萜苷类化合物为栀子的主要成分，栀子苷和山栀苷为其中的两种，绿原酸为栀子中有机酸酯类化合物含量较高的一种［11］。黄柏中的主要成分为生物碱类化合物，其中巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱都具有抗炎作用［12-15］。另外结合高分辨质谱对蓝芩口服液的多组分表征［16］，最终本实验确定了汉黄芩苷、黄芩苷、异牡荆苷、栀子苷、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱、鸟苷、汉黄芩素、黄芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山栀苷和绿原酸等16种活性成分作为目标，建立LC-MS/MS定量分析的测定方法，更加全面有效地对蓝芩口服液进行质量控制。也为其他蓝芩制剂的质量控制研究提供参考。

1 仪器与试剂

UPLC-MS/MS ACQUITY UPLC 和XevoTQ-S Micro 三重四极杆质谱仪（美国 Waters 公司）；XPRI0型电子天平（瑞士梅特勒公司）。

汉黄芩苷对照品（批号wkq22022807，含量98%）、黄芩苷对照品（批号wkq22010409，含量98%）、异牡荆苷对照品（批号wkq22051104，含量98%）、栀子苷对照品（批号wkq22011304，含量98%）、巴马汀对照品（批号wkq22070507，含量98%）、盐酸黄柏碱对照品（批号wkq22022407，含量98%）、木兰花碱对照品（批号wkq21083001，含量98%）、盐酸小檗碱对照品（批号wkq22010610，含量97.8%）、鸟苷对照品（批号wkq21042810，含量98%）、汉黄芩素对照品（批号wkq22012903，含量98%）、黄芩素对照品（批号wkq22030204，含量98%）、腺苷对照品（批号wkq22040708，含量98%）、胞苷对照品（批号wkq22021607，含量98%）、表告依春对照品（批号wkq22012803，含量98%）、山栀苷对照品（批号wkq22032806，含量98%）、绿原酸对照品（批号wkq22032106，含量98%）均购自四川省维克奇生物科技有限公司；蓝苓口服液（江苏扬子江制药有限公司，批号21080331，21011032，21081081，21081182，21071821；规格10 mL）；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；水为屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为FortisXi C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，95%A；2～5 min，92%→85% A；5～7 min，85%→70% A；7～10 min，70%→65% A；10～11 min，65%→60% A；11～12 min，60%→30% A；12～13 min，30%→5% A；13～15 min，5% A；15～15.1 min，5%→95% A；15.1～18 min，95% A）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；总运行时间18 min；进样量：2 μL。

2.2 质谱条件脱溶剂气：氮气（600L/h）；毛细管电压：2.5 kV（正离子模式）和2.0 kV（负离子模式）；离子源：ESI 源；离子源温度：150 ℃去溶剂温度：550 ℃。多反应检测（MRM）方式进行定量分析。离子化模式见表1。

表1 蓝芩口服液16种化合物的离子化模式

2.3 混合对照品储备溶液的制备分别精密称取汉黄芩苷、黄芩苷、异牡荆苷、栀子苷、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱、鸟苷、汉黄芩素、黄芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山栀苷和绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，配成浓度分别为0.512，0.563，0.576，0.596，0.580，0.592，0.537，0.526，0.539，0.521，0.537，0.536，0.528，0.567， 0.586，0.526 g/L的单一成分对照品储备液。精密量取16 种单一对照品储备液适量制成汉黄芩苷、黄芩苷、异牡荆苷、栀子苷、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱、鸟苷、汉黄芩素、黄芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山栀苷和绿原酸浓度分别为 51.20，157.6，0.144 0，447.0，0.812 0，8.288，7.518，7.364，0.970，7.294，7.518，7.504，1.056，7.938，8.204，7.364 mg/L 的混合对照品储备溶液。

2.4 供试品溶液的制备精密量取蓝苓口服液（批号21080331）3 mL 置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。进样前用0.22 μm 的滤膜过滤，待进样分析。

2.5 专属性试验精密量取“2.3”项下的混合对照品储备液5 mL 至25 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液，分别精密移取空白溶剂、混合对照品溶液和供试品溶液各2 μL。按照“2.1”项下色谱条件和“2.2”项下质谱条件进样分析，得到空白溶剂、蓝苓口服液中16 种活性成分的混合对照品、供试品溶液的NMR 色谱图。结果显示，在18 min 内，16 种活性成分分离良好无干扰，且峰形良好。

2.6 标准曲线的测定、线性范围及检出限取“2.3”项下混合对照品储备溶液，逐级稀释成系列不同浓度的对照品溶液，进样测定。以对照品浓度（x）为横坐标，对照品峰面积（y）为纵坐标，对其进行线性回归分析。结果见表2。结果表明，16 种化合物在各自的浓度范围内呈良好的线性关系。由检测限和定量限结果可以看出，本方法灵敏度较高。

表2 蓝芩口服液16种化合物的回归方程、相关系数、线性范围

2.7 仪器精密度试验取“2.5”项下混合对照品溶液进样分析，连续进样6次，每次2 μL，记录峰面积，结果汉黄芩苷、黄芩苷、异牡荆苷、栀子苷、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱、鸟苷、汉黄芩素、黄芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山栀苷和绿原酸峰面积RSD 分别为2.31%，1.62%，1.95%，1.86%，1.43%，1.06%，2 .08%，1.22%，1.99%，1.32%，1.09%，1.12%，2.11%，1.52%，1.95%，1.36%。结果表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验按“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h 进样2 μL 测定。计算汉黄芩苷、黄芩苷、异牡荆苷、栀子苷、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱、鸟苷、汉黄芩素、黄芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山栀苷和绿原酸含量的 RSD 分别为1.41%，1.87%，1.56%，1.06%，1.08%，0.99%，2.08%，1.67%，1.34%，1.04%，1.09%，1.29%，2.07%，1.25%，1.97%，1.26%。表明供试品溶液室温放置24 h稳定。

2.9 重复性试验按“2.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液，依法进样分析，计算得汉黄芩苷、黄芩苷、异牡荆苷、栀子苷、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、小檗碱、鸟苷、汉黄芩素、黄芩素、腺苷、胞苷、表告依春、山栀苷和绿原酸平均含量分别为0.348，1.054，0.004，3.014，0.008，0.066，0.056，0.054，0.007，0.060，0.057，0.053，0.009，0.053，0.066，0.059g/L，RSD 分别为2.03%，1.89%，1.93%，2.06%，1.83%，1.96%，2.08%，1.83%，1.28%，2.34%，1.39%，2.26%，2.28%，1.73%，1.57%，1.93%。表明方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验分别精密量取供试品0.75mL 至50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别精密加入“2.3”项下的混合对照品储备溶液2.5、5、7.5 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成低中高三种浓度，每个浓度平行3 份，总共9 份，进样测定分析，记录峰面积，计算加样回收率。16 种活性成分的回收率为91.7%～ 108.3%，表明该方法回收率良好。结果见表3。

表3 蓝芩口服液中16种成分的回收率试验结果（n=9）

2.11 样品的含量测定分别测定5 个批号蓝苓口服液中16种化合物的含量，结果见表4。

表4 样品测定结果/（n=5，g/L）

从结果可以看出，不同批号间16种活性成分含量差异较大，可能是原料、储存运输等条件的差异造成的。因此对蓝苓口服液进行多组分的定量检测是十分必要的。

3 讨论

3.1 流动相的选择水相比较了水、0.1%甲酸溶液、0.01 mol/L 醋酸铵溶液，发现水相中加入少量的甲酸后，各化合物均具有较好地响应。

有机相比较了乙腈和甲醇溶液，在乙腈系统下，各化合物峰形更好。通过优化色谱梯度条件，能够在18 min分离检测到16种成分，使检测效率显著提高。

3.2 色谱柱的选择较好的分离可以避免化合物间的干扰，提高质谱响应。但由于检测成分较多，常规液相色谱柱分析时间太长。为了提高效率，我们选择小内径和粒径的超高压色谱柱，在保证有效分离的同时大大缩短分析时间。我们比较了Fortis Xi C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Kromasil C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和WatersBEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），三种色谱柱均具有较好的分离效果，说明色谱条件耐用性较好。为了和前期研究相统一，我们最终选择了Fortis Xi C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。

3.3 质谱条件的优化笔者通过多次单独优化各成分的锥孔电压和碰撞能量，根据质谱响应确定定量离子对，山栀苷和绿原酸在负离子模式下基线噪音更小，检出限更低，质谱响应更高，故对山栀苷和绿原酸在负离子模式下进行定量分析。

3.4 结果分析现有国家标准仅要求栀子苷的含量不得少于2.50 g/L，由检测结果得知5 个批次均符合标准的要求。另外，由检测结果可看出，蓝芩口服液中栀子苷、黄芩苷和汉黄芩苷含量较高，栀子中的栀子苷和黄芩中的黄芩苷、汉黄芩苷可能是蓝芩口服液发挥疗效的主要成分。异牡荆苷、巴马汀、鸟苷和胞苷含量较低，且胞苷无紫外吸收，通过HPLC 无法对其进行检测，在蓝芩口服液的现有研究报道中未发现对巴马汀的定量分析，因此，本实验所建立的含量测定方法成功测定蓝芩口服液中的微量成分对蓝芩口服液的质量控制研究具有重要意义。但由检测结果可以明显看出，16 种活性成分批次间含量差异较大，在生产蓝芩口服液时应该在其原材料水平上进行严格质量控制，以保证各批产品的质量稳定。由于中药成分极其复杂多样，故只对其中一种成分进行含量要求无法安全、有效、全面地对蓝芩口服液进行质量控制，因此，对蓝芩口服液进行多组分定量分析是十分必要的。