血清半乳糖凝聚素-3、α-klotho表达与代谢相关脂肪性肝病糖脂水平及预后的关系

孙玉，南照林，张彦敏，秦维

作者单位：保定市人民医院肝病科，河北 保定 071000

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球慢性肝病的主要原因，其发展机制复杂、影响因素众多，2020 年正式更名为代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）［1］。MAFLD 的病理范围很广，包括没有肝损伤的单纯性脂肪变性、伴有或不伴有可导致肝癌晚期纤维化和肝硬化的非酒精性脂肪性肝炎［2］。由于其多变的病理特点，很难确定与MAFLD病人预后不良相关的影响因素［3］。α-klotho 是一种多功能蛋白，主要由肾脏分泌，在抗氧化应激，调节自噬，促进能量代谢，抑制炎症反应等方面发挥重要作用［4］。半乳糖凝聚素-3（galectin-3，Gal-3）是一种纤维化蛋白，研究表明Gal-3 在代谢性疾病中发挥着重要的作用，如非酒精脂肪性肝炎、糖尿病等［5-6］。

为进一步确定两种因子在MAFLD 病人血清中的表达情况及与糖脂代谢、预后的相关性，本研究检测并分析了α-klotho、Gal-3在MAFLD 病人血清中的表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020 年12 月至2021 年12 月来保定市人民医院就诊并确诊为MAFLD 病人112例为研究对象，根据非酒精性脂肪性肝病肝纤维化评分（NAFLD fibrosis score，NAFLDFS）将病人分为肝纤维化危险组（n=46），其中男25 例，女21 例，年龄（46.33±11.62）岁。无肝纤维化组（n=66）其中男36例，女30例，年龄（45.66±9.65）岁。

纳入标准：（1）符合亚太肝病研究学会代谢相关脂肪性肝病临床诊疗指南（2020 版）中MAFLD 的诊断标准［7］；（2）病人年龄范围为20～60岁。

排除标准：（1）合并严重心脑血管疾病、严重肾功能不全、感染性疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、恶性肿瘤病人；（2）精神障碍、智力障碍者；（3）哺乳期、妊娠期妇女或近期准备妊娠者；（4）依从性差者；（5）不稳定糖尿病、近3 个月内应用过节食减肥治疗、近1 个月内使用过降脂、降糖或降压药物者。按照年龄、性别随机分层选取50例健康者为对照组，其中男30 例，女20 例，年龄（44.24±10.35）岁。肝纤维化危险组、无肝纤维化组、对照组性别构成比、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，并获得所有受试者的书面同意。

1.2 方法

1.2.1标本采集 病人于治疗前，对照组于体检当日抽取5 mL 空腹静脉血，并于治疗6 个月后采集病人空腹静脉血5 mL。采用3 000 r/min 离心处理15min，取上层血清置于-80 ℃条件下保存备用。

1.2.2酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中α-klotho、Gal-3 水平 ELISA 法检测α-klotho、Gal-3表达水平。试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，并严格根据制造商的实验说明书进行检测。

1.2.3肝纤维化程度评估及预后评估 肝纤维化程度评估：使用NAFLDFS，NAFLDFS=-1.675+0.037×年龄（岁）+0.094×身体质量指数（BMI）（kg/m2）+1.13×糖尿病（是=1，否=0）+0.99×AST/ALT-0.013× 血小板（×109/L）- 0.66× 白蛋白（g/dL）；NAFLDFS＜-1.455 为无肝纤维化，≥-1.455 为肝纤维化危险［8］。

进行基础治疗6 个月之后（均采用相同药物治疗方案，服用脂肪肝颗粒），采用NAFLDFS评估病人预后情况，NAFLDFS 评分＜0.676，为肝纤维化程度较轻，纳入预后良好组（n=74）；NAFLDFS 评分≥0.676，为肝纤维化程度较严重，纳入预后不良组（n=38）［9］。

1.2.4观察指标 收集所有研究对象临床一般资料，包括性别、年龄，检测病人BMI、空腹血糖（fasting plasma glucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、胰岛素抵抗（HOMA-IR）、总胆固醇（total choles terol，TC）、三酰甘油（riacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）天冬氨酸转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷氨酰转肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）、血小板（platelets，PLT）、血清白蛋白（albumin，Alb）等生化指标。HOMA-IR计算公式为FBG×FINS/22.5。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料符合正态分布，以±s表示，两组定量数据比较采用t检验，多组数据之间比较利用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用SNK-q检验；计数资料采用例（%）表示，进行χ2检验；采用Pearson 法分析α-klotho、Gal-3 表达的相关性，及两者分别与糖脂代谢指标的相关性。采用受试者操作特征（ROC）曲线评估α-klotho、Gal-3 对MAFLD 病人预后不良的预测能力，确定α-klotho、Gal-3 评估MAFLD 病人预后不良的灵敏度和特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较与对照组相比，肝纤维化危险组与无肝纤维化组MAFLD 病人FBG、FINS、HOMAIR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 水平升高，HDLc、PLT、Alb 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与无肝纤维化组，肝纤维化危险组病人GGT、FBG、FINS、AST、ALT 水平升高，PLT、Alb 水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 代谢相关脂肪性肝病112例及健康者50例一般资料比较

2.2 各组MAFLD病人血清中α-klotho、Gal-3表达水平比较MAFLD 病人血清中α-klotho 表达水平低于对照组，其中肝纤维化危险组病人血清中α-klotho 表达水平低于无肝纤维化组，差异有统计学意义（P＜0.05）。MAFLD 病人血清中Gal-3 表达水平高于对照组，其中肝纤维化危险组病人血清中Gal-3表达水平高于无肝纤维化组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 代谢相关脂肪性肝病112例及健康者50例血清中α-klotho、Gal-3表达水平比较/± s

表2 代谢相关脂肪性肝病112例及健康者50例血清中α-klotho、Gal-3表达水平比较/± s

注：Gal-3为半乳糖凝聚素-3。①与对照组相比，P＜0.05。②与无肝纤维化组相比，P＜0.05。

组别对照组无肝纤维化组肝纤维化危险组F值P值Gal-3/（μg/L）1.48±0.47 1.96±0.33①2.26±0.50①②40.95＜0.001例数50 66 46 α-klotho/（ng/L）268.15±82.13 215.51±70.33①140.49±45.16①②42.04＜0.001

2.3 代谢相关脂肪性肝病治疗前后α-klotho、Gal-3表达水平及NAFLDFS评分比较肝纤维化危险组和无肝纤维化组病人治疗前后血清中Gal-3、α-klotho水平及NAFLDFS 评分比较，均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 代谢相关脂肪性肝病治疗前后α-klotho、Gal-3表达水平及NAFLDFS评分比较/± s

表3 代谢相关脂肪性肝病治疗前后α-klotho、Gal-3表达水平及NAFLDFS评分比较/± s

注：Gal-3为半乳糖凝聚素-3。

组别肝纤维化危险组α-klotho/（ng/L）Gal-3/（μg/L）NAFLDFS/分例数46治疗前治疗后t值P值无肝纤维化组140.49±45.16 205.39±60.21 5.848＜0.001 2.26±0.50 1.86±0.39 4.278＜0.001 1.94±0.05 0.78±0.13 56.485＜0.001 66治疗前治疗后t值P值-1.81±0.38-3.01±0.97 9.358＜0.001 215.51±70.33 259.44±80.57 3.337 0.001 1.96±0.33 1.55±0.28 7.696＜0.001

2.4 代谢相关脂肪性肝病不同预后病人α-klotho、Gal-3 表达水平比较预后不良病人血清中Gal-3水平高于预后良好病人，α-klotho 水平低于预后良好病人，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 代谢相关脂肪性肝病不同预后病人血清中α-klotho、Gal-3表达水平比较/± s

表4 代谢相关脂肪性肝病不同预后病人血清中α-klotho、Gal-3表达水平比较/± s

注：Gal-3为半乳糖凝聚素-3。

组别预后不良组预后良好组t值P值Gal-3/（μg/L）2.31±0.51 1.97±0.35 4.15＜0.001例数38 74 α-klotho/（ng/L）135.89±45.67 209.78±67.33 6.08＜0.001

2.5 MAFLD 病人血清中α-klotho、Gal-3表达的相关性分析相关分析结果显示，MAFLD 病人血清中α-klotho、Gal-3 表达呈显著负相关（r=-0.49，P＜0.05）。

2.6 血清中α-klotho、Gal-3 表达与糖脂代谢指标的相关性分析Pearson 法分析结果显示，MAFLD病人血清中α-klotho 表达与FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 表达呈负相关，与HDL-c、PLT、Alb 表达呈正相关（P＜0.05）。Gal-3 表达与FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT表达呈正相关，与HDL-c、PLT、Alb表达呈负相关（P＜0.05）。见表5。

表5 血清中α-klotho、Gal-3表达与糖脂代谢指标的相关性分析

2.7α-klotho、Gal-3水平预测MAFLD 病人预后的ROC 分析ROC 曲线结果显示，血清α-klotho、Gal-3 水平评估预后不良病人的曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）分别为0.83，95%CI：（0.75，0.89）；0.84，95%CI：（0.75，0.90），对应的灵敏度分别为86.84%、80.90%，特异度分别为66.22%、82.02%。血清α-klotho、Gal-3 水平联合评估预后不良病人的AUC 为0.93，95%CI：（0.87，0.97），灵敏度为86.84%，特异度为89.19%。

3 讨论

最近，MAFLD 正成为最常见的肝病，影响全球约25%的人口［10］。其发病率会随着年龄的增长而增加，如果不加以治疗，会发展为非酒精性脂肪性肝炎，大约20%的非酒精性脂肪性肝炎病人会进展为纤维化。大约20%的纤维化病人会发展为肝硬化，这最终会导致肝脏失代偿，并可能增加患肝细胞癌的风险［11-12］。大部分病人在经过治疗后会预后较好，但因为该疾病的发病机制及发病原因较为复杂，仍然有部分病人存在预后不良，严重影响人们的生活质量［13］。因此，寻找可靠的分子生物标志物来评估MAFLD病人预后迫在眉睫。

Gal-3 是一种β-半乳糖苷结合蛋白，是14 种哺乳动物凝集素家族碳水化合物结合蛋白之一，它在包括细胞黏附和生长在内的多种生物过程中发挥作用。有大量关于Gal-3 在许多疾病中的文献，包括纤维化疾病、心血管疾病、心力衰竭、神经退行性疾病和各种癌症［14-15］。研究表明在健康的肝脏中，只有巨噬细胞和胆管细胞表达Gal-3，而在肝硬化病人中，肝细胞是这种蛋白的主要来源［16］。此外何婷等［17］研究表明Gal-3 参与糖代谢异常的发生，其作用对肥胖、糖尿病、血脂异常等疾病的防治提供了新线索。在本研究中MAFLD病人血清中Gal-3表达水平高于健康者，且随着MAFLD 病人肝纤维化的发生而升高。预后不良病人血清中Gal-3 水平高于预后良好病人，提示Gal-3 表达升高与MAFLD 疾病的发生发展密切相关，可能预示MAFLD 病情越严重以及预后不良。与健康者相比，MAFLD 病人血清中FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 表达水平均升高，HDL-c、PLT、Alb 表达水平均降低，这与王艳等［18］研究结果相一致。相关性分析显示Gal-3 在MAFLD 病人血清中的表达与FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-c、AST、ALT、GGT 表达呈正相关，与HDL-c、PLT、Alb 表达呈负相关，表明MAFLD 病人肝脏糖脂代谢均发生异常，可能通过破坏机体代谢平衡参与疾病发展进程。本研究发现，血清Gal-3 水平评估预后不良病人的AUC 为0.84，对应的灵敏度为80.90%，特异度为82.02%。提示Gal-3水平在MAFLD病人预后判断中有一定价值，对病人制定适宜的治疗方案具有重要意义。

Klotho基因家族，包括α-、β-和γ-Klotho，在调节人类衰老和与年龄相关的疾病发展中发挥着关键作用［19］。其中α-Klotho 蛋白是一种130 kDa 的单跨膜蛋白，其表达已在肾脏和甲状旁腺中得到证实［20］。聂礼强等［21］研究表明α-Klotho可能通过引起糖脂代谢紊乱等导致肾脏炎症反应参与2型糖尿病肾病的病情进展。在本研究中MAFLD 病人血清中α-klotho 表达水平低于健康者，且随着肝纤维化以及预后不良的发生而逐渐降低，进一步通过相关性研究发现α-klotho 与Gal-3 表达呈负相关，提示α-klotho与Gal-3之间可能存在负反馈调节机制，共同参与MAFLD 的发生、发展过程。此外α-klotho 与糖脂代谢指标均存在相关性，表明α-klotho 表达与糖脂水平密切相关，提示可通过调节病人血清中α-klotho表达水平，控制病人体内糖脂代谢水平，并进一步改善病人预后。进一步研究发现，血清α-klotho 水平评估预后不良病人的AUC 为0.83，对应的灵敏度为86.84%，特异度为66.22%。血清α-klotho、Gal-3 水平联合评估的AUC 为0.93，灵敏度为86.84%，特异度为89.19%，提示α-klotho、Gal-3 二者联合应用于MAFLD 病人预后评估的临床价值优于单一指标。

综上所述，α-klotho 在MAFLD 病人血清中表达降低，Gal-3表达升高，二者与MAFLD 病人糖脂水平和预后密切相关，可为MAFLD 疾病进展和预后评估提供参考依据，α-klotho、Gal-3可能是一种新型的MAFLD 血清生物标志物，具有重要的临床意义。但本研究尚未探讨其中的作用机制，未来将进一步揭示α-klotho、Gal-3在MAFLD中的具体机制。