非酒精性脂肪性肝病病人血清长链非编码NTF3-5水平与胰岛素抵抗的关系

陈旋

作者单位：武汉市蔡甸区人民医院检验科，湖北 武汉 430000

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种无过度饮酒和其他明确原因造成的肝脏损害性疾病，目前已经成为最常见的肝病之一，目前的流行病学研究估计，到2030年，相关肝硬化和终末期肝病的全球患病率将增加2～3倍［1］。NAFLD 被认为与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）相关，是代谢综合征（metabolic syndrome，MS）的肝脏表现。过去的研究表明，患有胰岛素抵抗的NAFLD 病人发生非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纤维化和因肝脏相关疾病死亡的风险更高。最近的一项荟萃分析报告称，以胰岛素抵抗为特征的2 型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）病人NAFLD 发病率比非糖尿病病人高2 倍以上［2-3］。因此寻找可以有效诊断NAFLD 的标志物，具有重要意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作为一种重要的新型调控因子，影响着代谢疾病的多种生物学过程和发病机制［4］。现有证据表明，LncRNA 参与了包括NAFLD 在内的肝脏疾病的发生和发展［5］。其中，长链非编码NTF3-5（Lnc-NTF3-5）参与多种疾病的发生和发展，如肿瘤和骨科疾病。Zhang等［6］研究表明，Lnc-NTF3-5表达水平在高糖环境中升高，可促进胰岛β 细胞增殖。而胰岛β 细胞的功能与NAFLD 病人胰岛素抵抗的关系已经有所研究［7］，但目前Lnc-NTF3-5在NAFLD 中的表达尚不清楚，因此本研究通过检测NAFLD 病人血清中Lnc-NTF3-5 的表达情况，探讨其在NAFLD 中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019 年12 月至2020 年12 月来武汉市蔡甸区人民医院就诊并确诊为NAFLD 病人115 例（根据简单随机抽取法确定样本量），其中男性61 例，女性54 例，年龄范围为24～65 岁，年龄（48.33±10.62）岁。根据疾病严重程度分为重度组（33例），中度组（40例），轻度组（42例）。纳入标准：（1）诊断标准符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南（2018 年更新版）》［8］；（2）病人或其近亲属签署知情同意书；（3）年龄＞18 岁；（4）无肝脏超声影像异常或肝功能检查异常史。排除标准：（1）有大量饮酒者，吸毒者；（2）有肝炎携带者、糖尿病、高血压、血液透析慢性肾功能衰竭、充血性心力衰竭或其他已知主要疾病；（3）孕产妇。同时选取55 例健康者为健康对照组，其中男性30 例，女性25 例，年龄范围为28～55 岁，年龄（45.24±10.35）岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1标本采集 所有研究对象均采集空腹静脉血5 mL，放入离心机，采用3 000 r/min 离心处理15min 后取血清置于-80 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪器（日本Olympus AU5421型全自动生化分析仪及配套试剂）检测两组研究对象血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰基转移酶（glutamyltransferase，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、空腹血糖（FPG）水平；化学发光法（试剂盒购自Beckman公司）检测空腹血胰岛素（FINS）；胰岛β 细胞功能用胰岛β 细胞功能指数（HOMA-β）表示，HOMA-β=20×FINS/（FPG-3.5）［9］；采用稳态胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）评价胰岛素抵抗状态。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，HOMA-IR≥2.69定义为IR［10］。

1.2.2实时荧光定量PCR 法检测血清中Lnc-NTF3-5 水平 取低温保存的血清标本500 μL，置于离心机中，在10 000 r/min 条件下离心2 min，取上层血清200 μL 转移到新的离心管中，加入Trizol 裂解剂，充分混匀震荡，提取总RNA。取总RNA 1 μg作为模板进行反转录，获得cDNA。以cDNA 为模板，采用实时荧光定量PCR 法检测Lnc-NTF3-5的表达水平。PCR 反应体系为：cDNA 模板2 μL，miScript SYBR®Green Mix 10 μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，无RNA 酶的灭菌水3.0 μL。反应条件：95 ℃下预变性10 min；然后以95 ℃变性30 s；60 ℃退火20 s；70 ℃延伸10 s 的条件进行，共设40个循环，所有条件均按照检测系统严格进行。采用2-ΔΔCt法对血清Lnc-NTF3-5 表达水平进行定量分析。Lnc-NTF3-5 及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.3 统计学方法利用SPSS 22.0 进行统计学分析，计数资料采用例（%）表示，行χ2检验；计量资料符合正态分布以±s表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步采用NK-q方法进行组间比较；采用Pearson 法分析Lnc-NTF3-5 表达水平与肝功能指标及糖脂代谢等指标的相关性。利用受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价血清中Lnc-NTF3-5 表达水平、HOMA-IR 水平对NAFLD 发生的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较健康对照组和NAFLD 组性别、年龄、ALP比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。NAFLD 组病人TG、TC、LDL-C、ALT、GGT、AST、FPG、FINS、HOMA-β 均显著高于健康对照组，HDL-C 低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 非酒精性脂肪性肝病组与健康对照组一般资料比较

2.2 各组血清中Lnc-NTF3-5 表达水平及HOMAIR 比较NAFLD 病人血清中Lnc-NTF3-5 表达水平、HOMA-IR 高于健康对照组，且NAFLD 重度组高于中度组，中度组高于轻度组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 非酒精性脂肪性肝病轻、中、重度组与健康对照组血清中Lnc-NTF3-5表达水平及稳态胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较/± s

表3 非酒精性脂肪性肝病轻、中、重度组与健康对照组血清中Lnc-NTF3-5表达水平及稳态胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较/± s

注：①与健康对照组比较，P＜0.05。②与轻度组比较，P＜0.05。③与中度组比较，P＜0.05。

例数55 42 40 33 Lnc-NTF3-5 1.01±0.23 1.32±0.31①1.53±0.37①②2.02±0.43①②③67.41＜0.001组别健康对照组轻度组中度组重度组F值P值HOMA-IR 1.36±0.48 1.98±0.64①2.49±0.81①②3.75±1.23①②③66.02＜0.001

2.3 Lnc-NTF3-5 与HOMA-IR 的相关性分析Pearson 法分析结果显示，NAFLD 病人血清中Lnc-NTF3-5 表达水平与HOMA-IR 呈正相关，差异有统计学意义（r=0.37，P＜0.001），见图1。

图1 NAFLD病人血清中Lnc-NTF3-5表达水平与HOMA-IR相关性分析

2.4 血清中Lnc-NTF3-5 表达水平、HOMA-IR 与糖脂代谢指标、肝功能指标的相关性分析将NAFLD 病人血清中Lnc-NTF3-5 表达水平以及HOMA-IR 分别与TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、GGT、AST、FPG、FINS、HOMA-β进行相关性分析，结果表明Lnc-NTF3-5、HOMA-IR 均与HDL-C 呈负相关（P＜0.05），而与TG、TC、LDL-C、ALT、GGT、AST、FPG、FINS、HOMA- β 均呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 Lnc-NTF3-5表达水平、HOMA-IR与糖脂代谢指标、肝功能指标的相关性

2.5 Lnc-NTF3-5、HOMA-IR 对NAFLD 病人的诊断价值ROC 结果显示，Lnc-NTF3-5、HOMA-IR 及二者联合预测NAFLD 病人的曲线下面积、灵敏度、特异度见表5。

表5 HOMA-IR、Lnc-NTF3-5水平对NAFLD病人诊断价值

3 讨论

据报道，在中国和发达国家，约20%和25%的人患有NAFLD，无论是否有肝硬化，这些病人都有患肝细胞癌的风险。尽管尚未完全阐明，但NAFLD被认为源于不合理的饮食摄入、生态失调、遗传和表观遗传易感性、肥胖、代谢综合征和胰岛素抵抗［11］。其中胰岛素抵抗属于代谢异常，常在NAFLD和NASH 病人中观察到［12］。胰岛素抵抗是指靶组织对胰岛素作用的反应低于预期，导致不同水平的糖脂代谢受损，容易导致T2DM 的发生。胰岛素抵抗涉及的主要部位是骨骼肌、肝脏和脂肪组织，这些器官之间的主动串扰可能是NAFLD 和NASH 发展的主要因素［2］。因此研究胰岛素抵抗的分子机制对NAFLD的防治具有重要意义。

LncRNA 是一种长度超过200个核苷酸，不具有蛋白质翻译能力的RNA 转录本［13］。它可以通过染色质修饰沉默或介导基因激活来充当转录调节剂。LncRNA 参与细胞生长、分化、凋亡、肿瘤转移等多种细胞过程。目前LncRNA 越来越多地被关注于肝病的发病机制，并已被证明具有潜在的诊断、预后和治疗的重要性［14］。LncRNA 与糖尿病及其并发症也有密切联系，有望成为新的诊断标志物和治疗靶点［15］。闫春英等［16］研究表明LncRNA H19 在NAFLD 病人血清中高表达，且与肝脏脂肪变性及严重程度相关。此外其他研究人员发现LncRNAMEG 可以促进成骨分化，可能具有与LncRNA-MODR 和LncRNA-MEG 相似的功能［6］。在本研究中NAFLD 病人血清中Lnc-NTF3-5 表达水平和HOMAIR 均高于健康对照组，且NAFLD 重度组病人高于中度组病人，中度组病人高于轻度组病人，提示Lnc-NTF3-5和胰岛素抵抗参与NAFLD的发生、发展过程，且与疾病的严重程度密切相关。目前有研究显示，LncRNA 可通过多种途径在肝脏糖脂代谢中发挥重要作用［17］，莫石柯［18］研究发现，肝硬化病人体内存在胰岛素抵抗，且合并糖尿病时更加明显。本研究通过Pearson 法进行相关性分析，结果显示NAFLD 病人血清中Lnc-NTF3-5 表达水平和HOMAIR 均与HDL-C 呈负相关，而与TG、TC、LDL-C、ALT、GGT、AST、FPG、FINS、HOMA-β 均呈正相关，提示NAFLD 病人存在一定程度的糖脂代谢异常和肝功能异常，Lnc-NTF3-5 可能通过影响机体内糖脂代谢及肝功能等相应指标、调控胰岛素抵抗而影响疾病的进程。此外，血清中Lnc-NTF3-5 表达水平与HOMA-IR 呈正相关，提示Lnc-NTF3-5 与胰岛素抵抗相关。ROC 结果显示，Lnc-NTF3-5 水平、HOMAIR 预测NAFLD 病人的AUC 分别为0.85、0.83，对应的灵敏度分别为72.17%、61.74%，特异度分别为89.09%、98.18%，二者联合预测NAFLD 病人的AUC为0.88，灵敏度为76.52%，特异度为96.36%，优于单一指标检测。提示Lnc-NTF3-5、HOMA-IR望成为早期诊断NAFLD的指标。

综上所述，Lnc-NTF3-5在NAFLD病人血清中呈高表达，与NAFLD 病人糖脂代谢和肝功能关系密切，且Lnc-NTF3-5 与HOMA-IR 呈正相关，二者有望成为早期诊断NAFLD及病情评估的指标。