红根病感染对橡胶树根际土壤微生物群落和代谢物的影响

戴利铭，李岚岚，刘一贤，施玉萍，蔡志英

（云南省热带作物科学研究所/云南省天然橡胶可持续利用研究重点实验室（筹）/天然橡胶良种选育与栽培技术国家地方联合工程研究中心，云南 景洪 666100）

根病是限制国内橡胶单产提高的关键因子之一，在我国胶园发病率2%以上［1］。我国橡胶树（Hevea brasiliensis）上发现的根病有7 种，分别为红根病、褐根病、紫根病、臭根病、白根病、黑根病和黑纹根病，其中红根病发病率最高［2］。红根病是 由 橡 胶 树 灵 芝 [Ganoderma pseudoferreum（Wakef.）Over. et Steinm]侵染引起的橡胶树根部病害［3］，橡胶树受到该病菌侵染后，顶端叶片变小，叶蓬蓬距缩短，呈伞状，病树中后期树头有条沟，常见枣红色或红黑色菌膜。病根表面平，附着一层泥沙，用水较易洗掉，洗净后常见枣红色革质菌膜。病根木材湿腐、松软，呈海绵状，皮层和木质部间有一层白色到深黄色腐竹状菌膜［4］。

相关研究表明，病原菌侵染植物能够改变植株根际土壤、茎秆以及叶际微生物群落结构。刘海洋等［5］研究不同发病程度的黄萎病棉田土壤真菌群落，发现重病棉田土壤真菌OTU 数量、丰度均高于轻病或无病田，真菌多样性却较低。周凌云等［6］研究不同茶白星病病情等级下茶叶叶际细菌群落，发现在不同发病等级茶树叶片上的优势门类均为酸杆菌门、拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门。罗路云等［7］研究不同白粉病病情等级下南瓜叶际细菌群落结构和多样性，发现不同发病等级南瓜叶片上的优势门均是放线菌门、拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门。

作物根部土壤中微生物群落结构及其组成变化能反映土壤生态现状及变化趋势，对作物健康十分重要。而根际代谢物是研究植物根系中产生的代谢产物，包括有机酸、氨基酸、糖类、激素等，这些代谢物对植物的生长发育和适应环境起着重要的作用。根际内源性小分子的变化能反映蛋白、生物基因、外环境等多因素作用下的综合效应［8］，对根际代谢物的分析有助于理解土壤生物之间化学信号交流的生物学过程。

宏基因组学是一门研究环境中全部遗传物质的学科，它为未培养微生物的发现、寻找新功能基因、活性物质开发和微生物多样性研究提供更全面的遗传信息［9-14］。代谢组学是对生物体所有代谢物进行定量分析［15-16］，根际代谢物的变化可为研究代谢通路、生物代谢标志物、酶活性的变化等提供依据。本研究基于高通量测序和代谢组技术对采自云南省景洪市红根病橡胶树和健康橡胶树根际土壤中的微生物群落结构及代谢物进行了研究，以期揭示橡胶树感染红根病后根际土壤中微生物和代谢物的变化情况，探寻该病害发生与危害的微生态机制，为采取生物技术措施确保橡胶林土壤健康提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 样品采集

2020年9月于云南省景洪市勐养榕树1 组橡胶林（101°88′41″E，22°08′48″N）红根病发生林地（1998年种植的‘GT1’）进行样品采集。随机选取3 株感染红根病的橡胶树，铲除表层土壤后收集须根1 cm 范围的土壤，此即为感染红根病的根际土壤组（M）样品；在该地区未发病的橡胶树中随机选取3 株无明显病症的健康植株，采集根际土壤样品，即为健康株根际土壤组（C）样品。样品采集后放入液氮中速冻低温保藏，运回实验室后置于-80℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂和仪器

土壤样品DNA 提取试剂盒，上海玉博生物科技有限公司；PCR 仪，Applied Biosystems 公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

1.3 DNA 提取及宏基因组测序

称取充分混匀的土壤样品0.50 g，采用土壤样品DNA 提取试剂盒提取DNA。利用NanoDrop 2000 检测抽提DNA 的浓度和纯度。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送上海百趣公司进行Hiseq 高通量测序（Illumina PE150）。

1.4 代谢组样品制备及检测

将采集后的样本液氮速冻后送上海百趣公司进行GC-TOF-Ms 代谢组学检测。GC 分析条件:色谱柱Agilent DB-5MS 毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；色谱柱升温程序为初始温度50℃，保持1 min，以10℃/min 升至310℃，并保持8 min；进样口温度为280℃；载气、辅助气均为氦气，载气流速为1 mL/min（恒流），不分流进样。MS 分析条件为EI 离子源，电离电压70 eV；离子源温度为250℃；传输线温度为280℃；全扫描质谱，扫描范围为50～500 m/z。

1.5 宏基因组测序的生物信息学分析

原始数据使用Bowtie2 V2.2.4 软件进行质控，过滤reads 尾部质量值低于20 的碱基，然后去除质控后50 bp 以下的reads 以及含N 碱基的reads。根据序列首尾两端的barcode 和引物区分样品，调整序列方向，使用MEGAHIT 软件进行序列拼接。使用DIAMOND 软件将Unigenes 与从NCBI 的NR 数据库中抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒序列进行比对；采用KEGG［17］、eggNOG［18］、CAZy［19］数据库的比对结果并绘制功能基因的分类柱状图。

1.6 代谢组数据分析

GC-MS 数据采用ChromaTOF 软件（V 4.3x，LECO）对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。并与Fiehn 数据库比对，对相似度大于70%的化合物予以认定，将已鉴定的物质的峰面积进行标准化，然后导入统计软件SIMCA-P 16.0.2 进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal to partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），通过载荷图、模型的变量重要性因子（Variable importance factor，VIP）和方差分析（nalysis of variance，ANOVA）寻找在健康土壤和发病土壤间差异显著的代谢物。

1.7 宏基因组与代谢组学关联分析

获取宏基因组差异菌群和代谢组学差异代谢物的含量信息，利用Spearman 算法进行相关性计算。

2 结果与分析

2.1 土壤宏基因组物种注释分析

在门分类上，健康和发病土壤中共检测到156个菌门，1 977 个属，其中发病土壤特有159 个属，健康组特有的属122 个。从门分类层级的相对丰度表出发，选取各样品中最大相对丰度排名前10的物种，并将其余的物种设置为Others，绘制出门水平的相对丰度柱形图（图1）。发现相对丰度最高的是酸杆菌门（Acidobacteria），在发病土壤和健康土壤中均占比30%以上，表明酸杆菌门为优势菌群，在各样本微生物群落结构中占主导地位。其次是放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria），相对丰度在14.00%～21.00%，绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度在3.4%～3.9%。其余芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、Candidatus Rokubacteria、装甲菌门（Armatimonadetes）的相对丰度均小于3.00%。和健康土壤相比，发病土壤中酸杆菌门相对丰度高出5.11%，放线菌门和变形菌门相对丰度明显减少，减少值分别为2.8%和5.3%。

图1 组间物种相对丰度柱形图（门）

从属分类层级的相对丰度表出发，选取在各样品中最大相对丰度排名前20 的物种，并将其余的物种设置为Others，绘制属水平相对丰度柱形图（图2）。结果显示健康土壤中相对丰度最高的是根瘤菌属（Bradyrhizobium），为1.87%，其次为链霉菌属（Streptomyces）和CandidatusSolibacter，分别为1.73%和1.23%；而发病土壤中相对丰度最高的是链霉菌，为1.63%，其次为CandidatusKoribacter和克特多杆菌（Ktedonobacter），分别为1.33%和1.35%。两种土壤样本中相对丰度排名前20 的属相同，均为短根瘤菌属（Bradyrhizobium）、克特多杆菌（Ktedonobacter）、链霉菌属、CandidatusSolibacter、马杜拉放线菌属（Actinomadura）、CandidatusKoribacter、苯基杆菌属（Phenylobacterium）、脱氮单孢菌属（Pedosphaera）、Edaphobacter、弗兰克氏菌属（Frankia）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、嗜热菌属（Thermogemmatispora）、盐杆菌属（Caulobacter）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）、Pseudonocardia、颗粒菌属（Granulicella）、嗜酸链球菌属（Streptacidiphilus）、小单孢菌属（Micromonospora）、红游动菌属（Rhodoplanes）、非洲诺卡氏菌属（Nonomuraea）。

图2 组间物种相对丰度柱形图（属）

红根病是由橡胶树灵芝侵染引起的橡胶树根部病害，而本次研究相对丰度排名前20 的属物种均不包含灵芝属。进一步研究发现在患病植株根际土壤和健康植株根际土壤中均有检测到红根病病原菌Ganoderma和褐根病病原菌Phellinus，说明云南省景洪市勐养榕树1 组橡胶林地中无明显病症的植株根部健康已经受到病原菌的威胁。

2.2 土壤宏基因组功能注释分析

2.2.1 KEGG 数据库注释

将测序结果与KEGG 数据库进行比对分析，结果如图3。从图中可以看出注释到碳水化合物代谢和氨基酸代谢相关的功能基因数目最多。发病土壤和健康土壤在碳水化合物代谢功能方面占比分别为5.0%和4.7%，在氨基酸代谢功能方面占比分别是4.5%和4.2%，两者在生命活动相关的基本功能方面无明显差异。

图3 KEGG功能注释相对丰度柱形图

2.2.2 CAZY 数据库注释

将测序结果与CAZy 数据库进行比对分析得到图4，分析发现主要涵盖6 大类：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs），糖基转移酶（Glycosyl Transferases，GTs），多糖裂合酶（Polysaccharide Lyases，PLs），碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs），辅助氧化还原酶（Auxiliary Activities，AAs）和碳水化合物结合模块（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs）。大多数基因集中在糖苷水解酶和糖基转移酶两种功能中，这可能与微生物对能量的摄取和运用有关，绝大多数细菌都是以糖作为碳源物质。在碳水化合物代谢方面，发病土壤和健康土壤没有显著差异。

图4 CAZy功能注释相对丰度柱形图

2.2.3 NOG 数据库注释

将测序结果与NOG 数据库进行比对分析得到图5，其功能主要包括ABC 转运，组蛋白激酶，转录调控，脱氢酶，转移酶，丝苏氨酸蛋白激酶，氧化还原酶和乙醇脱氢酶。在这些功能中和转、运激酶、氧化还原相关的功能丰度很高，说明土壤微生物的活力比较高，处于比较活跃的状态。ABC 转运蛋白（通透酶）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在发病土壤中均高于正常土壤，其他功能均低于正常土壤。

图5 eggNOG 功能注释相对丰度柱形图

2.3 差异代谢物筛选与层次聚类分析

从发病土壤对健康土壤的差异代谢物筛选获得9 大差异代谢物，包括蜡酸（Cerotinic acid）、甘油磷酸酯（D-（glycerol 1-phosphate）、胆固醇（Cholesterol）、胆甾烷-3,5，6-三醇（Cholestane-3beta，5alpha，6beta-triol）、富马酸（fumaric acid）、豆甾醇（Stigmasterol）、N-环己基甲酰氨（N-cyclohexylformamide）、花生四烯酸（Arachidonic acid）和N-乙酰基-5-羟色胺（N-Acetyl-5-hydroxytryptamine）。

将差异代谢物进行聚类热图分析得到图6。结果发现花生四烯酸和N-乙酰基-5-羟色胺从正常土壤到发病土壤含量为下降趋势，蜡酸、甘油磷酸酯、胆固醇、胆甾烷-3，5，6-三醇、富马酸、豆甾醇、N-环己基甲酰氨这7 个物质从正常土壤到发病土壤含量呈上升趋势。

图6 发病土壤对健康土壤的层次聚类分析热力图

2.4 差异代谢物与差异菌属的关联分析

为明确土壤中代谢物的改变与土壤菌群改变之间的关系，进一步对代谢组学获得的差异代谢物和宏基因组学数据获得的菌群进行了联合分析（图7）。结果显示，土壤中差异代谢物含量与其土壤菌群中多种细菌丰度显著相关。例如，在发病土壤中呈显著性降低的代谢物花生四烯酸含量与Runella和Candidatus Symbiobacter属丰度呈显著负相关，却与Acidiphilium、Belnapia、CandidatusEndobugula、Haematobacter、Lentibacillus、Oerskovia、Skermanella、Thioflexothrix丰度呈显著正相关。同时发病土壤中呈显著性降低的代谢物N-乙酰基-5-羟色胺与Caldivirga、CandidatusSymbiobacter丰度呈显著负相关，却与Xenophilus丰度呈显著正相关。

图7 差异代谢物与差异菌属的相关性热力图

与健康土壤相比，发病土壤中的蜡酸、甘油磷酸酯、胆固醇、胆甾烷-3，5，6-三醇、富马酸、豆甾醇、N-环己基甲酰氨等7 种代谢物的含量显著增加，其中蜡酸、胆甾烷-3，5，6-三醇含量与Acidiphilium、Acidisphaera、Basidiobolus、Belnapia、Catenibacterium、Cohaesibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum、Skermanella丰度呈显著正相关，却与CandidatusProtochlamydia、Acinetobacter丰度呈显著负相关。胆固醇含量与Acidisphaera、Basidiobolus、Cohaesibacter、Granulibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum丰度呈显著负相关，却与Acinetobacter丰度呈显著正相关。甘油磷酸酯含量与Belnapia、Basidiobolus、Granulibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum、Xenophilus丰度呈显著负相关，却与Acinetobacter、Caldivirga呈显著正相关。富马酸含量与Basidiobolus、Cohaesibacter、Granulibacter、Magnetospirillum、Microterricola丰度呈显著负相关，却与Acinetobacter 丰度呈显著正相关。豆甾醇含量与Acetobacter、Acidisphaera、Basidiobolus、Catenibacterium、Cohaesibacter、Haematobacter、Thioflexothrix丰度呈显著正相关。N-环己基甲酰氨含量与Acidiphilium、Acidisphaera、Belnapia、Catenibacterium、Cohaesibacter、Magnetospirillum、Nitrospirillum、Skermanella丰度呈显著负相关，却与Runella、CandidatusProtochlamydia丰度呈显著正相关。

3 小结与讨论

本研究对小勐养植胶区红根病发生林地的健康和发病的土壤进行了调查取样，通过宏基因组测序并分析了土壤宏基因组物种组成。在门分类上，健康和发病土壤中共检测到156 个菌门，1 977 个属，其中发病土壤特有的属159 个，健康组特有的属122 个。在门分类水平，酸杆菌门的微生物为发病土壤相对丰度最高的门，在土壤占比为30%以上，在各样本微生物群落结构中占主导地位。发病土壤中的酸杆菌门微生物丰度比健康土壤中高5.11%，而放线菌门和变形菌门丰度低于健康土壤。在属分类水平，健康土壤中相对丰度最高的是根瘤菌属，其次为链霉菌属，而发病土壤中相对丰度最高的为链霉菌属。根瘤菌属为有益菌，不仅与豆科植物共生结瘤固氮，促进植物生长，还可增强植物抗病、抗逆性［20］。KEGG 功能注释发现发病土壤和健康土壤在碳水化合物代谢、氨基酸代谢功能这两个属于生命活动的基本功能方面无明显差异。NOG 数据库注释发现ABC 转运蛋白和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶在发病土壤中均高于正常土壤。

利用GC-MS 非靶向代谢组学技术对感病与健康根际土壤代谢成分进行测定，与健康土壤相比，发病土壤中的蜡酸、甘油磷酸酯、胆固醇、胆甾烷-3，5，6-三醇、富马酸、豆甾醇、N-环己基甲酰氨等7 种代谢物含量显著增加；而花生四烯酸和N-乙酰基-5-羟色胺等2 种代谢物含量显著降低。值得注意的是，余鑫平研究发现小花假泽兰中的豆甾醇具有抑菌活性［21］，而豆甾醇与Acetobacter、Acidisphaera、Basidiobolus、Catenibacterium、Cohaesibacter、Haematobacter、Thioflexothrix呈显著正相关，推测植物患病会引起以上菌株丰度的改变。

本次研究中，红根病和褐根病病原菌在患病植株根际土壤和健康植株根际土壤中都有发现，说明云南省景洪市勐养榕树1 组橡胶林地中无明显病症的植株根部健康已经受到病原菌的威胁，建议该地区重视，做好防治工作。