灵芝菌发酵枇杷叶茶的研制

赖腾强，谢 娜，吴伯文，盛子煊，林文辉

（1.福建农业职业技术学院，福州 350007；2.武平县农鑫食用菌专业合作社，福建 龙岩 364309）

灵芝（Ganodermn lucidum）为我国传统名贵中药，也是我国目前研究和开发较多的药用菌［1］。灵芝含有多糖类、三萜类、核苷类、生物碱、氨基酸及微量元素等多种活性物质［2］，其中多糖和三萜类化合物是灵芝的主要活性成分。现代药理研究表明，灵芝具有扶正固本，防治呼吸道疾病，调节血脂，保护心脑血管，调节血糖，减轻、延缓糖尿病并发症，提高免疫力，辅助治疗肿瘤等功效。

枇杷叶[Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.]是传统医药学常用中草药，药用历史悠久［3］。目前从枇杷叶中分离的化学成分主要有黄酮类、三萜酸类、倍半萜类、多酚类等。现代药理学研究表明，枇杷叶具有抗炎、止咳作用，临床常用于治疗急慢性呼吸道等疾病［3］。此外，枇杷叶还有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、保肝利胆、清除氧自由基、增强机体免疫功能等作用。

灵芝有2 000 多年的食用历史，有延年益寿的功效，但我国食用过灵芝的人群还不到百分之一，长期食用的人更少，且以老年人养生为主。我国枇杷叶资源十分丰富，但没有得到有效利用，甚至成为植物垃圾，对环境造成污染。目前关于枇杷叶、灵芝的加工利用研究多集中在药用方面，而在养生食品方面的研究较少。2014年枇杷叶被批准为新食品原料［4］，2019年对灵芝开展药食同源物质管理试点工作［5］，极大地推动了枇杷叶、灵芝在养生食品方面的发展，相关新产品层出不穷，功能性开发方面也得到拓展。本研究以枇杷叶为主料，利用灵芝菌来发酵枇杷叶，通过发酵、加工技术将发酵后的枇杷叶制成养生茶，为枇杷叶的深加工提供新的途径。

1 材料和方法

1.1 原料

发酵原料：干枇杷叶（条状）、PDA 培养基、小米（带壳）、玉米粉、甜叶菊（粉状）等。

灵芝菌种：共10 个菌株，详见表1。

表1 菌株编号与来源

1.2 研制工艺

1.2.1 工艺流程

灵芝菌发酵枇杷叶茶工艺流程如图1 所示，主要包含灵芝母种制备、灵芝原种制备、枇杷叶发酵培养、发酵茶处理工艺、发酵茶检验方法、发酵茶成品包装等流程。

图1 灵芝菌发酵枇杷叶茶工艺流程

1.2.2 工艺说明

（1）灵芝母种制备

采用PDA 培养基，蒸馏水1 000 mL，pH 值自然。1.8 cm×18 cm 试管做容器，用试管塞封口，制作试管斜面，斜面长8 cm。采用高压灭菌，压力0.11 MPa、温度121℃，灭菌30 min。在超净工作台内按无菌要求接种，取0.5 cm×0.5 cm 母种菌块接种在试管斜面中间，在温度25℃培养箱中暗光培养，菌丝长满斜面（图2a）即成母种，放置于冰箱低温保藏或用于接种原种。

（2）灵芝原种制备

采用小米作为基质，料水比为1∶1.2，pH 值自然。用350 mL 的广口组培瓶做容器，装入量为料高2～3 cm，按料水比加水，用塑料盖封口。灭菌、接种、培养同母种制备；取1.5 cm×1.5 cm 母种菌块接种在组培瓶料面中间，培养箱中培养；菌丝长满（图2b）后即成原种，放置于冰箱低温保藏或用于接种枇杷叶。

（3）枇杷叶发酵培养

选用无病虫害的成熟枇杷叶，按干叶∶水=1∶1.5 加水混合，pH 值自然。充分均匀吸收水分后用17 cm×33 cm×0.05 cm 的聚丙烯塑料袋装料，料高12 cm，用套环封口。灭菌、接种、培养同母种制备；将小米原种搅碎，取小米原种接种到枇杷叶培养基上，置于培养箱中培养（图2c）；待菌丝长满培养基时终止发酵（图2d）。

（4）发酵茶处理工艺

挑选菌丝浓白、无污染的发酵茶（图2e），取出菌质摊开在搪瓷盘中（图2f）在110～120℃温度下烘至六七成干，即发酵茶不黏手时进行初包揉；再于90～100℃温度下烘1.5 h，烘至发酵茶有微感刺手时进行复包揉处理。采用“低温慢烤”，70～80℃温度下烘干，稍经摊凉即可（图2g）。

（5）发酵茶检验方法

根据GB/T 5009.57—2003茶叶卫生标准的分析方法对灵芝菌发酵枇杷叶茶进行卫生指标检验。

（6）发酵茶成品包装

经卫生检验后，可直接用茶叶袋包装成茶，或与金线莲、山楂、红枣、枸杞等复配成养生茶（图2h），也可粉碎加工制作成袋泡茶。

1.3 研制方法

1.3.1 灵芝菌株筛选

将10 个灵芝菌株接种到PDA 培养基上，在25℃的培养箱中暗光培养，每处理重复5次。观测各菌株的萌发时间、满管时间、菌丝长速、菌丝长势等，以萌发早、满管快、长速快、长势好的菌株作为发酵菌株。

1.3.2 枇杷叶配方筛选

为尽可能保持枇杷叶的风味，只适当添加少量的其他辅料，设计3 个配方：配方A，枇杷叶100% ；配方B，枇杷叶99%+玉米粉1%；配方C，枇杷叶99%+甜叶菊1%。

将小米原种接种到枇杷叶培养基上，在25℃的培养箱中暗光培养，每处理重复5 次。当菌丝盖面并向下深入2～3 cm，画线做起始线，当菌丝即将满袋时，画线做终止线；用直尺测量起始线与终止线之间的距离，计算菌丝生长速度。观测各菌株的萌发时间、盖面时间、满袋时间、菌丝长势等。

对经1.2.2（4）处理工艺得到的灵芝菌发酵枇杷叶茶，取2 g 用100 mL 的开水冲泡，经3 min 后，从色泽、香气、滋味、杂质等方面进行鉴评。

1.3.3 营养成分测定

灵芝菌丝长满枇杷叶培养基时终止发酵，取出菌质后在60℃恒温下烘干，粉碎过30 目筛；同批次未发酵的枇杷叶粉碎过30 目筛，为待测样品。

测定枇杷叶发酵前后（配方A）的多糖、三萜酸、总蛋白、游离氨基酸含量。多糖测定以葡萄糖为对照品，采用蒽酮-硫酸法；三萜酸测定以熊果酸为对照品，采用香草醛-冰醋酸法；总蛋白测定采用凯氏定氮法；游离氨基酸测定采用茚三酮显色法。

1.3.4 质量安全检测

随机抽取发酵后（配方A）的枇杷叶，对重金属指标、农残含量进行质量安全检测，检测项目及检测依据［6-11］见表2。

表2 重金属指标、农残含量检测项目及依据

2 结果与分析

2.1 灵芝菌株筛选结果

从表3 可知，在萌发时间上，LZ04、LZ10 为1.5 d，其余均只需1 d，差异不显著。在满管时间上，菌株之间存在一定的差异性：LZ07 最快，只需6 d；其次是LZ09、LZ02、LZ08，需6.5～7.0 d；LZ04 最慢，需要11 d。在菌丝生长速度上，菌株之间存在一定的差异性：LZ07 最快，达0.772 cm/d；其次是LZ09，为0.717 cm/d；LZ04最慢，只有0.392 cm/d；LZ07、LZ09 菌丝生长速度较其他菌株差异极显著。在菌丝长势、外观上：LZ07、LZ09 长势最好，菌丝洁白浓密；其次是LZ01、LZ02、LZ03、LZ06、LZ08，菌丝洁白密集；LZ04、LZ05、LZ10 较差，菌丝洁白均匀。LZ07、LZ09 表现出萌发早、满管快，菌丝生长速度快，菌丝长势好、洁白浓密，可作为发酵枇杷叶的灵芝菌株。

表3 不同灵芝菌株在母种培养基中的生长情况

2.2 枇杷叶配方筛选结果

从表4 可知，2 个灵芝菌株在3 个枇杷叶培养基中生长良好。在萌发时间、盖面、满袋天数上，相差不大，差异不显著。在菌丝生长速度方面，从菌株上看，LZ07 生长速度较LZ09 快，在配方A、B、C 上的生长速度分别快0.05、0.045、0.042 cm/d；从配方上看，2 个灵芝菌株均表现出生长速度配方B＞配方C＞配方A，但差异不显著。在菌丝长势、外观上，2 个灵芝菌株均表现出配方B、配方C长势好于配方A，菌丝洁白浓密。配方B、配方C生长速度、长势都好于配方A，说明添加玉米粉、甜叶菊能够促进灵芝菌丝的生长。

表4 不同灵芝菌株在枇杷叶培养基中的生长情况

从色泽、香气、滋味、杂质等方面进行鉴评，2个灵芝菌株分别利用3 个枇杷叶配方发酵出的香气、杂质无差别，均表现出香气清淡，带点甜香，无絮状沉淀物，在色泽、滋味方面有所差别，配方A、C 汤色黄褐色，配方B 汤色较浅，应是添加玉米粉影响致汤色浑浊；配方C 有淡淡的甜味，配方A、B 甜味较弱，应是添加甜叶菊增加了甜味，多次冲泡后滋味明显减淡。

2.3 营养成分测定结果

从表5 可知，经灵芝菌发酵后，2 个灵芝菌株发酵后的枇杷叶中多糖、总蛋白、游离氨基酸含量均有所增加，但三萜酸含量有所下降。从营养上看，发酵后的枇杷叶中多糖分别增加18.48%、30.52%，总蛋白分别增加45.94%、51.53%，游离氨基酸分别增加66.81%、61.38%，三萜酸分别下降12.24%、16.78%。从菌株上看，LZ07、LZ09 发酵后的枇杷叶中营养成分含量有所差别，但含量此消彼长，无法判断其营养价值的高低。

表5 发酵前后枇杷叶的营养成分比较 单位：%

2.4 质量安全检测结果

从表6 结果可知，铅（0.062 mg/kg）、镉（0.021 mg/kg）、总砷（0.046 mg/kg）、总汞（0.004 mg/kg）含量均小于检测标准指标，二氧化硫、百菌清、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、乐果、咪鲜胺含量小于定量限/检出限或未检出标准，表明发酵后的枇杷叶重金属、农残含量均符合检测标准，处于安全的含量水平。

表6 发酵后的枇杷叶重金属指标、农残含量检测结果

3 小结与讨论

灵芝菌株筛选研究表明，菌株之间的菌丝生长速度存在一定的差异性；LZ07、LZ09（美芝、大红芝）菌丝生长速度较其他菌株差异极显著，且表现出萌发早、满管快，菌丝长势好、洁白浓密，可作为发酵枇杷叶的灵芝菌株。

枇杷叶配方筛选研究表明，灵芝菌株LZ07 菌丝生长速度较LZ09 快；生长速度为配方B＞配方C＞配方A，但差异不显著；添加玉米粉能够促进灵芝菌丝的生长，添加少量的甜叶菊有助于提升灵芝菌发酵枇杷叶茶的口感。陈艳琦等［12］研究添加玉米粉对玉木耳菌包质量、产量和营养成分的影响，结果表明添加玉米粉对菌丝恢复能力、菌包质量均有所改善，产量有所增加，营养成分含量有所提高。玉米粉、甜叶菊的添加量或添加其他辅料对灵芝菌发酵枇杷叶茶品质的影响有待进一步研究。

枇杷叶发酵前后的营养成分测定结果表明，灵芝菌株LZ07、LZ09 发酵后的枇杷叶中多糖、总蛋白、游离氨基酸含量均有所增加，但三萜酸含量下降，这与张平等［13］的研究结果一致。不同灵芝菌株发酵后的枇杷叶营养成分有所差别，存在此消彼长的情况。料水比、灭菌时间、发酵时间等是否对发酵茶的营养成分有影响，有待进一步探讨。

对枇杷叶发酵后的质量安全检测研究表明，发酵后的枇杷叶重金属、农残含量均符合检测标准，处于安全的含量水平，为确保灵芝菌发酵枇杷叶茶在正常饮用量下对人体的安全性，后续还需要进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺式菌等致病菌，急性毒性、半数致死量（LD50）、骨髓细胞微核的检测［14］。

目前将枇杷叶作为新食品原料的产品品类还比较少，主要集中在饮料和代用茶类，功能应用上，对其功能的利用还比较粗糙，缺乏针对性［15］。枇杷叶价格低廉，且产地丰富，应用前景广阔。利用灵芝菌发酵枇杷叶制作养生茶，可开拓枇杷叶在食品方面的市场，拓展枇杷叶的产业链。本研究只适当添加了少量的玉米粉、甜叶菊作为辅料，以尽可能保持枇杷叶的风味，灵芝菌发酵枇杷叶茶还可以在产品方面研发更多的品类。

发酵后的枇杷叶茶是枇杷叶与灵芝的有机结合，在营养功效上有很好的互补性，有协同的养生功效。发酵后的枇杷叶茶有淡淡的枇杷叶香和灵芝的特殊菌香，开水冲泡后茶汤色更浓郁，表明有较多的固形物析出。灵芝菌丝多糖、三萜和蛋白在提高免疫、抗肿瘤、抗衰老、保肝等方面有重要作用，较高含量的总游离氨基酸使得口感更美味润滑。灵芝菌发酵枇杷叶茶值得进一步推广，可为灵芝、枇杷叶的综合利用提出一条新途径。