华蟾素对HepG2/ADM细胞耐药的抑制作用及其机制研究*

陈婷 李嘉龙 白蕊 史晓燕 段丽芳 李翠娟,3 范妤,3**

(1.陕西中医药大学基础医学院,陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学医学技术学院,陕西 咸阳 712046;3.陕西省中医体制与疾病防治研究重点实验室,陕西 咸阳 712046)

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一,病发率和死亡率均位居癌症前列[1-3]。当前临床多采用手术、化疗、中药及联合疗法等治疗方式。由于多数患者发病隐匿,发现时多已是中后期,使得治疗选择受限,化疗成为肝癌患者治疗的主要手段[4]。对化疗药物产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)是化疗中常见的棘手现象,极大程度降低了化疗药物治疗效果[5]。近年来,多药耐药性成为临床肝癌治疗中亟待解决的问题[6-9]。有研究发现,多数化疗药物可以通过诱发肿瘤细胞凋亡发挥抑癌的作用,而肿瘤细胞对化疗药物的抗凋亡作用则是诱发MDR的重要机制之一[10-11]。

华蟾素是由干蟾皮通过水提醇沉法获得的中成药制剂,广泛应用于肝癌[12-15]、肺癌[16-18]、乳腺癌等多种恶性肿瘤[19-21]的临床治疗中,疗效显著。有研究显示,华蟾素及其有效成分可通过激活线粒体凋亡途径诱发大脑胶质瘤[22]、淋巴瘤等[23]恶性肿瘤细胞凋亡。华蟾素还可以提高肺癌细胞对化疗药物的敏感性[24],但目前关于华蟾素对肝癌化疗中耐药作用及其作用机制的研究却鲜有报道。本研究以人肝癌HepG2细胞和阿霉素耐药细胞株HepG2/ADM为研究对象,从对细胞增殖的影响、细胞内阿霉素积累和凋亡相关蛋白的表达等方面深入探究华蟾素逆转HepG2/ADM细胞耐药的机制,旨在为华蟾素的临床应用提供可靠的理论依据。

1 材料

1.1细胞 人肝癌 HepG2由陕西中医药大学晁旭教授惠赠,HepG2/ADM细胞购自广州吉妮欧生物有限公司(批号:20220723)。

1.2药物与试剂 将华蟾素胶囊(陕西东泰制药有限公司,批号:1K0907151)溶于DMSO溶液(DMSO终浓度<0.1%);以DMEM基础培养基稀释为相应质量浓度应用于实验,即用即配[25];阿霉素购于深圳万乐药业有限公司(批号:2110E2);青霉素链霉素混合液(货号P1400),胰蛋白酶(货号:T1300),噻唑兰(货号:1334MG250)购自北京Solarbio公司;胎牛血清(货号:FSP500)购自依科赛生物公司;DMEM 培养基(货号XT-SH30022,01B)购于美国hyclone公司;Caspase-3一抗(货号:19677-1-AP)购于美国Proteintech 公司;Caspase-9一抗(货号:9508S)购于美国 Cell Signaling Technology;BAX一抗(货号:sc-20067)、Bcl-2 一抗(货号:sc-56015)购于美国santa cruz公司;β-actin一抗(货号:bs-0061R)、羊抗兔HRP标记二抗(货号:BA1135)、羊抗小鼠HRP标记二抗(货号:BA1050)购自购自武汉博士德生物科技有限公司。

1.3仪器 高速低温离心机(Eppendorf 5430R);超低温冰箱(Thermo Scientific Forma 702);分析天平(中国Mettler Toledo);制冰机(宁波 Grant XB100);涡旋混合器(美国 Scientific Industries);水平摇床(海门 Kylin-Bell BETS-M5);蛋白印迹电泳系统(美国 Bio-Rad);凝胶成像系统(Protein Simple FluorChemFC3);超净工作台(苏州净化设备);超纯水器(美国 Millipore);细胞培养箱(美国 Nuaire NU-4950E);倒置显微镜(日本 Olympus)。

2 实验方法

2.1细胞培养 HepG2细胞于含 12%胎牛血清和 1%双抗的 DMEM 培养基中培养;HepG2/ADM细胞接种于加入1 μg·mL-1阿霉素的HepG2细胞培养基中,维持细胞的耐药特性[26]。细胞均置于 37 ℃、5% CO2恒温恒湿培养箱中孵育,在对数生长期进行后续实验。

2.2华蟾素对HepG2、HepG2/ADM细胞增殖的影响 分别制备密度为1×105个·mL-1的HepG2、HepG2/ADM细胞悬液,以100 μL/孔接种于96孔板。待细胞贴壁后,给予HepG2细胞含有0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、10 μg·mL-1华蟾素干预;给予HepG2/ADM细胞含有0、1、2、4、8、16、32 μg·mL-1华蟾素干预;继续培养24 h后,加入20 μL/孔 MTT溶液,避光孵育4 h,弃去液体后加入150 μL/孔 DMSO,室温震荡10 min,紫色结晶完全溶解后,全自动酶标仪在490 nm 处测定吸光度(OD)值,计算细胞增殖抑制率=(1-华蟾素组OD值/空白对照组OD值)×100%;计算华蟾素对两种细胞的半数抑制率(IC50)及药物的耐药倍数,耐药倍数=IC50耐药株/IC50敏感株[27]。每组6个复孔,重复测定3次。

2.3倒置显微镜观察HepG2/ADM细胞形态学变化 将密度为1×105个·mL-1HepG2/ADM细胞悬液接种于96孔板,100 μL/孔。待细胞贴壁后分别加入0、4、8、16 μg·mL-1华蟾素溶液,继续培养24 h,倒置显微镜下观察细胞形态变化。

2.4药物蓄积实验 把实验分为HepG2组、HepG2/ADM组、不同浓度华蟾素组。分别将密度为1×104个·mL-1的HepG2细胞和HepG2/ADM细胞,接种于24孔板内,孵育24 h后,HepG2组、HepG2/ADM组加入基础培养基,不同浓度华蟾素组分别加入含4、8、16 μg·mL-1华蟾素的基础培养基。继续培养24 h后,除HepG2组外,其余各组均加入含5 μg·mL-1阿霉素的培养基,孵育4 h,4%多聚甲醛避光固定35 min后加入DAPI染液室温避光放置5 min,抗荧光淬灭封片剂封片,避光存放。荧光显微镜下观察并拍照。细胞核呈紫蓝色荧光,阿霉素自发红色荧光。采用 ImageJ6.0软件计算细胞阿霉素荧光强度值。

2.5Western blot实验检测凋亡相关蛋白的表达 分组及处理方法同2.4,收集细胞,提取总蛋白,BCA法定量蛋白浓度,制备上样蛋白,经电泳分离、转膜、封闭后,分别加入 Bcl-2抗体(1∶1500)、Bax抗体(1∶1000)、Caspase-9抗体(1∶1000)、 Caspase-3抗体(1∶1000)、β-actin抗体(1∶1000),4 ℃孵育过夜;室温孵育二抗,凝胶成像仪显影。应用Image J6.0 软件分析蛋白条带灰度值。

3 结果

3.1华蟾素抑制HepG2、HepG2/ADM细胞增殖 与空白组比较,华蟾素在0.125至10 μg·mL-1浓度范围能够抑制HepG2细胞增殖,统计学差异显著(P<0.01),IC50为(11.27±1.15)μg·mL-1;华蟾素在1至32 μg·mL-1浓度范围能够抑制HepG2/ADM细胞增殖(P<0.01),IC50为(52.60±11.04)μg·mL-1。华蟾素对两种细胞的增殖抑制作用均具有剂量依赖性。耐药倍数为4.67。根据华蟾素对HepG2/ADM细胞的增殖抑制情况,选取4、8、16 μg·mL-1作为后续处理剂量。结果见图1,2。

注:与空白对照组相比**P<0.01

注:与空白对照组相比**P<0.01

3.2华蟾素对HepG2/ADM细胞形态学变化影响 倒置显微镜下观察华蟾素对 HepG2/ADM 细胞形态的影响,结果显示, HepG2/ADM 细胞形态清晰,有明显突起,贴壁牢固。经华蟾素干预 24 h后,随着药物浓度的增加,细胞数量减少,体积变小,细胞皱缩突起减少,贴壁松散,细胞间连接减少。见图3。

图3 华蟾素对HepG2/ADM细胞形态学变化影响(×200)

3.3华蟾素对HepG2/ADM细胞药物蓄积的影响 与HepG2细胞组比较,HepG2/ADM细胞中ADM的含量无显著差异(P>0.05)。与HepG2/ADM细胞比较,华蟾素处理组细胞中ADM的含量显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见图4。

注：与HepG2组相比与##P<0.01;与HepG2/ADM组相比**P<0.01

3.4华蟾素对 HepG2/ADM 细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与HepG2细胞组比较,HepG2/ADM细胞中Bcl-2 蛋白表达显著升高,Caspas e-9 蛋白表达下降(P<0.05),Bax 及 Caspase-3 蛋白表达无显著变化(P>0.01);与HepG2/ADM细胞比较,华蟾素处理组 Bax、Capase-9 及 Caspase-3 蛋白表达水平显著升高, Bcl-2 蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结果见图5。

注：与HepG2组相比与#P<0.05,##P<0.01;与HepG2/ADM组相比*P<0.05,**P<0.01

4 讨论

全球范围内,肿瘤疾病已经成为人类重大的公共健康问题之一,在我国肝癌的发病率和死亡率均位居消化系统恶性肿瘤前列[1]。目前临床治疗主要以手术、化疗、放疗、中药及联合治疗等,由于肝癌发病隐匿,多数患者失去了手术机会,因此化疗成为多数肝癌患者采用的主要治疗方案,化疗药物易发生多药耐药,使患者对药物敏感性下降,成为致使化疗疗效不尽如人意的主要原因之一[9]。

中医药是中华文明的瑰宝,来源于天然动植物药物显示出良好的抗癌功效。中药复方、中药注射液、中药单体在逆转肝癌化疗耐药方面机制研究也日益增加。华蟾素是从蟾蜍中提取分离出的主要活性成分,具有抗炎、镇痛及抗肿瘤等多种功效,对包括肝癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞具有明显的杀伤作用[24]。

本实验研究中,我们选用HepG2细胞作为对照,以HepG2/ADM细胞株作为研究对象。MTT实验结果显示,华蟾素对HepG2和HepG2/ADM细胞具有显著的增殖抑制作用,且具有明显的剂量依赖性;倒置显微镜下观察发现,经华蟾素处理度干预后,随着药物浓度的增加,HepG2/ADM细胞数量减少,体积变小,细胞皱缩突起减少,细胞间连接减少,贴壁不牢固,形态学变化与MTT结果相符。

阿霉素(Adriamycin,ADM),也称多柔比星(Doxorubicin,Dox),是蒽环类家族成员,具有细胞毒性,临床多作为肝癌及其他肿瘤的一线化疗药。阿霉素穿过细胞膜在细胞内聚集能够自发红色荧光,这一特点便于观察药物在细胞内的蓄积情况[28]。荧光显微镜下观察显示,与HepG2和HepG2/ADM细胞相比,华蟾素处理后的HepG2/ADM细胞,胞质中红色荧光明显增强增多,表明ADM在HepG2/ADM细胞中含量增加,外排减少,HepG2/ADM对ADM的敏感性增强。

肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药的原因和机制复杂,主要与影响凋亡调控的相关蛋白表达、药物靶点基因突变、酶系统活跃、自噬诱导、ABC 转运蛋白的高表达等多种因素有关[11]。凋亡蛋白的异常调控是肿瘤细胞产生多药耐药的重要原因[29]。多数化疗药物能够通过诱导肝癌细胞凋亡发挥抑瘤作用。线粒体不仅是细胞凋亡的触发开关、细胞死亡的直接通路,也与肿瘤多药耐药间存在密切关系[26,30]。Western blot实验结果显示,经华蟾素处理后,HepG2/ADM细胞中Bax、Caspase-9及Caspase-3蛋白表达水平可显著上调,Bcl-2 蛋白表达水平显著下调,表明华蟾素可以通过激活HepG2/ADM线粒体凋亡途径促进细胞凋亡,抑制HepG2/ADM细胞增殖。

综上所述,华蟾素对肝癌耐药细胞具有增殖抑制作用,可以通过增加阿霉素在细胞内蓄积增加、促进耐药细胞凋亡等方式发挥抗耐药作用。在后续研究中,我们也将对华蟾素联合化疗药物应用的疗效进行深入的在体和离体实验研究,为华蟾素在肝癌治疗的临床应用提供新的理论基础和实验依据。